瓜氨酸对盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠模型急性肾损伤的保护作用研究*

廖凯蔡彬罗玉龙黄伟张森△

(广西医科大学第一附属医院广西南宁530021)

[摘要]目的探讨瓜氨酸对盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠模型急性肾损伤的保护作用。方法选取96只成年雄性Wistar大鼠，按随机数字表法分为对照组、假手术组、脓毒症组、治疗组,每组6只。对照组不经任何处理；假手术组仅开腹翻动肠管后关腹；脓毒症组与治疗组行盲肠结扎穿孔术(Cecal Ligation and Puncture,CLP))；治疗组术前一周胃饲L-瓜氨酸200 mg/kg·d-1。造模24 h取血、处死大鼠，测定各组血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)浓度；肾脏组织行苏木素-伊红(HE)染色观测组织病理学改变；运用悬浮液相芯片技术检测各组肾脏组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达水平。结果与假手术组相比，脓毒症组血清尿毒氮、肌酐及肾组织TNF-α、IL-6水平均显著升高(P<0.05)，肾组织HE染色显示大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性。与脓毒症组相比，治疗组血清尿毒氮、肌酐及肾组织TNF-α、IL-6水平均明显下降，但仍高于假手术组(P<0.05)。肾组织病理改变也明显减轻。结论瓜氨酸可抑制肾脏组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-6的表达，说明瓜氨酸可能通过调节细胞因子表达水平，从而在脓毒症肾损伤的发生发展过程发挥保护作用。

[关键词]脓毒症;瓜氨酸;急性肾损伤;TNF-α;IL-6

基金项目：*国家自然科学基金(项目号：81160235)

通讯作者△

[中图分类号]R574.6[文献标志码]A

[收稿日期：2015-04-10]

Protective effects of citrulline on acute kidney injury induced by sepsis

Liao Kai，Cai Bin，Luo Yulong，et al.(Department of Colorectal and Anal Surgery,Nanning 530021,China)

Abstract[]Objective To investigate the protective effects on acute renal injury in rats with sepsis. Methods 96 cases of healthy and male Wistar rats were randomly divided into 4 groups which were control group(n=6),sham operation group(n=6),sepsis group(n=6) and treatment group(n=6). Normal control group without any Processing.Animal in sham group did laparotomy flip cecum after anesthesia,then closed the Peritoneal.Sepsis model was reproduced in sepsis group and treatment group with cecal ligation and puncture (CLP),and the rats of treatment group were given L- citrulline 200mg kg-1·d-1 for 7 days before operation. The rats were killed at 24h after operation.Then the concentrations of serum BUN and Cr, the histopathological changes of kidney were merasured, simultaneously monitored the expression level of TNF-a and IL-6 in kidney tissue by liquid chip technology.Results The Serum BUN , Cr and TNF-a , IL-6 level in the sepsis group were significantly increased more than those in the sham operation group(P<0.05) .Compared with the sepsis group, The Serum BUN , Cr and TNF-a , IL-6 level in the treatment group were significantly decreased(P<0.05).Conclusion citrulline inhibit the expression of proinflammatory cytokines TNF-α, IL-6 in renal tissue and reduce serum BUN and Cr concentration,improve kidney function and reduce renal histopathological damage in rats with sepsis.Description citrulline may pass regulate cytokines expression level, which is a protection role in the process of the development of sepsis-induced renal injury.

[Key words]Sepsis; Citrulline;acute kidney injury; TNF-α；IL-6

脓毒症是外科大手术后常见且最严重的并发症之一，亦是外科危重病房最常见的死亡原因[1]。近年来研究发现，急性肾损伤(AKI)是脓毒症患者死亡的首位独立危险因素[2]，预防和控制AKI在脓毒症患者中的发生发展可明显降低脓毒症患者死亡率。目前认为炎症介质、氧自由基、NO的过度生成与脓毒症AKI发生发展均密切相关[3]，其中抗炎/抑炎因子失衡是AKI发生发展的重要因素[4、5]。瓜氨酸是一类非必须氨基酸，可在体内转化为精氨酸，同时亦能负反馈调节NO生成[6]。国内外研究发现瓜氨酸可在大鼠缺血-灌注肾损伤以及糖尿病大鼠肾损伤中发挥保护作用[7、8]。本研究通过盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症大鼠模型，观察瓜氨酸对盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠模型急性肾损伤的保护作用，为临床降低术后脓毒症的死亡率提供新的思路和理论依据。

1材料和方法

1.1主要材料和仪器瓜氨酸(合肥博美生物科技有限责任公司)，生化自动分析仪(AU680，贝克曼)，液相芯片生物检测试剂盒(RECYTMAG-65K，Millipore)。

1.2实验动物和分组SPF级雄性Wistar大鼠24只，体重250~300 g，7~10周龄(广西医科大学实验动物中心提供)。按随机数字表分为四组：对照组、假手术组、脓毒症组、瓜氨酸治疗组各6只大鼠。

1.3动物模型制备wistar大鼠称重、编号。①对照组不做特殊处理。②假手术组采用10%水合氯醛0.45 Ml/100 g腹腔麻醉，开腹后翻动盲肠，缝合腹部切口。③脓毒症组行CLP术，麻醉后沿腹中线做一长约2 cm切口，定位盲肠后于50%长度处以手术丝线结扎，用12G无菌针头贯穿肠管，挤出少量肠内容物后原位回纳盲肠并缝合腹部切口。④治疗组术前一周瓜氨酸灌胃给药，剂量200 mg/kg·d-1。余操作同脓毒症组。

1.4标本采集与处理：各组大鼠于术后24 h麻醉后经腹主动脉取血5 mL，室温下静置，待血清析出后3000 r/min离心15 min，取上清-80℃保存备测。取血后处死大鼠，摘取左肾放入4℃生理盐水中漂洗，去除包膜，肾门结缔组织及血管。切取少量肾皮质以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，HR染色后光镜下观察肾组织病理变化。余标本-80℃保存备测。

1.5肾功能检测取各组大鼠血清标本1 mL，采用贝克曼全自动生化分析仪检测血清肌酐及尿素氮水平。

1.6肾组织TNF-α、IL-6、IL-10检测：采用LuminexTM2000液相芯片分析平台进行TNF-α、IL-6、IL-10检测，应用MasterPlexTMQT多元数据分析软件包绘制标准曲线，并进行曲线拟合得出相应细胞因子定量检测浓度。

2结果

2.1组织病理学观察对照组与假手术组未见明显病理改变；脓毒症组可见肾皮质及间质大量炎性细胞浸润，肾小管上皮肿胀、空泡变性，刷状缘广泛脱落，肾小管腔内可见少量蛋白管型。治疗组与脓毒症组相比，肾皮质及间质炎性细胞浸润减轻，仍可见肾小管上皮细胞肿胀，但变性显著减轻，肾损伤程度未见进一步扩大。(图1)

2.2肾功能指标变化脓毒症组血清尿素氮与肌酐较正常组与假手术组显著升高(P<0.01)；治疗组与脓毒症组比较，血清尿素氮及肌酐均明显下降(P<0.05)，但仍高于假手术组(P<0.05)，见表1。

2.3肾组织细胞因子水平测定对照组肾组织TNF-α与IL-6表达水平较低且较为平稳；脓毒症组TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.05)；与脓毒症组相比，治疗组TNF-α、IL-6水平明显下降(P<0.05)，见表1。

图1　大鼠肾脏HE染色(×400)

注：单因素方差分析假手术组与对照组比较，P>0.05；*与假手术组进行比较，P<0.05；

#与假手术组和脓毒症组进行比较，P<0.05

3讨论

在术后脓毒症患者中，肾脏是最易累及的器官之一，肾功能轻度损伤便可增加术后脓毒症患者的病死率[9、10]。目前研究显示，脓毒症肾损伤时，多种细胞因子相互作用，形成复杂交错的细胞因子网络，最终形成“瀑布效应”[11]，导致肾功能急剧下降，组织结构破坏。

细胞因子包括促炎和抗炎因子两类，正常状态下，促炎与抗炎因子相互之间维持动态平衡，而在脓毒症中促炎因子过度分泌和释放所导致的促炎/抗炎因子失衡是引发和加重脓毒症急性肾损伤的重要因素[12~14]。

TNF-α是炎症反应中最早分泌和释放、促炎作用最强的细胞因子之一也是炎症因子瀑布效应的始动因素。脓毒症中，内毒素(LPS)与血浆LPS结合蛋白(LBP)形成复合物(LPS-LBP)与单核/巨噬细胞表面CD14受体结合，通过JAK-STAT信号通路诱导TNF-α合成[15]，进而发挥泛生物学作用，诱发IL-1β、IL-6、IL-8等次级炎症因子的释放，放大炎症信号、形成级联效应[16]。本研究中，脓毒症组肾组织中TNF-α明显上升，伴有肾组织大量炎症细胞浸润、肾皮质细胞肿胀变性，以及血清尿素氮和肌酐的显著上升，提示脓毒症肾组织中大量TNF-α合成与释放增加，加剧肾小球炎症，继而损伤肾脏功能。

IL-6是次级促炎症细胞因子之一，其本身对细胞无直接损伤作用，能够增强次级炎症介质C5a发挥其促炎活性的作用。IL-6常作为细胞因子级联反应激活的一个标志，其水平可间接反应组织损伤程度[17]。本研究中，脓毒症组IL-6显著高于假手术组，提示脓毒症肾组织损伤，与国外Nechemia等人报道相一致[18]。

瓜氨酸(Citrulline)又名氨甲酰鸟氨酸，是一种不参与蛋白质合成的半必须α-氨基酸。正常机体瓜氨酸主要在小肠上皮细胞内合成，在肾脏中经肾小管上皮细胞转化为精氨酸，在维持蛋白平衡的过程中发挥重要作用[19、20]。此外瓜氨酸可以通过负反馈调节NO的生成，具有较高的临床价值。近年来，关于瓜氨酸的研究多集中于心血管疾病、代谢性疾病与抗炎等方面。在脓毒症中，患者血清瓜氨酸下降41%，且瓜氨酸水平低下与脓毒症预后不良有关[21]。Marini等亦发现肾功能损伤，阻碍瓜氨酸的从头合成途径，导致体内瓜氨酸水平大幅下降[22]。Persson发现为糖尿病小鼠补充外源性瓜氨酸可保护其肾功能，显著减轻肾小球纤维化和减少蛋白尿[23]。

盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠模型能较好模拟术后脓毒症患者的临床特点。在本研究中我们为治疗组补充外源性瓜氨酸，发现大鼠肾组织炎性浸润与肾小管上皮细胞肿胀变性程度较脓毒症组均有所减轻。而血清尿素氮与肌酐与脓毒症组相比亦有明显下降。说明瓜氨酸可减轻脓毒症的肾组织损伤，抑制血清尿素氮及肌酐水平，从而起到保护肾功能的作用。进一步研究表明，瓜氨酸的干预明显降低了肾组织TNF-α与IL-6的水平，提示瓜氨酸可能通过调控前炎因子TNF-α与IL-6表达在炎症早期即发挥作用。

综上所述，瓜氨酸能够抑制盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠模型肾组织中早期促炎介质TNF-α与IL-6的升高，调节机体促炎/抗炎因子平衡，保护肾功能减轻大鼠肾组织损伤，为术后脓毒症治疗提供了新的研究方向和理论基础。

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