结直肠癌粪便miRNA-21的表达及其临床意义*

钟武张磊昌钟世彪江志远陈利生郭云△

(广西医科大学第一附属医院结直肠外科广西南宁530021)

[摘要]目的初步探讨粪便miRNA-21在结直肠癌中表达的作用及临床意义。方法收集2014年5月至2014年7月间广西医科大学结直肠肛门外科收治病理诊断明确的30例结直肠癌患者粪便标本，另采集10例健康志愿者粪便作为对照组。采用免疫磁珠法分离粪便脱落细胞，RT-qPCR方法检测粪便miRNA-21的表达，分析miRNA-21的表达水平与临床病理因素的关系。结果RT-qPCR结果显示在结直肠癌患者粪便miRNA-21的表达水平高于正常人，两者间比较差异有统计学意义，P<0.05；根据临床病理因素的不同对结直肠癌患者进行分组比较，结果显示：Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者miRNA-21的表达水平要高于Ⅰ+Ⅱ期结直肠癌患者，P<0.05；低分化患者高于中高分化者P<0.05；有淋巴结转移患者明显高于无淋巴结转移者，P<0.05。结论结直肠癌粪便miRNA-21表达的升高可能参与了肿瘤的发生、发展，粪便miRNA-21可能成为结直肠癌潜在的肿瘤标记物，为结直肠癌的早期筛查、诊断提供了新的思路。

[关键词]结直肠癌；粪便；miRNA-21；免疫磁珠分选

基金项目：*2014年广西研究生教育创新计划资助项目(编号：YCBZ2014032)，桂教重点项目(编号：ZD2014029)

通讯作者△

[中图分类号]R735.3[文献标志码]A

[收稿日期：2015-02-28]

The expresson of fecal microRNA-21 in colorectal cancer

Zhong Wu,Zhang Leichang,Zhong Shibiao,et al.(Department and Anal Surgery,First AffiliatedHospital of GuangXi Medical University,Nanning 530021)

Abstract[]Objective To investigate the expression of fecal microRNA-21 (miRNA-21) in normal human and patients with colorectal cancer. Methods From May 2014 to July 2014, the fecal of 50 patients with colorectal cancer,who received treatment in the first affiliated hospital of Guangxi Medical Uuniversity, department of colorectal surgery, were collectted in this study. The fecal exfoliated cells were isolated by MACS (magnetic cell sorting). RT-qPCR technique was applied to detected the expression of miRNA-21 and analyzed the correlation of miRNA-21 and clinicopathological factors. Results The RT-qPCR result showed that patients with colorectal cancer expressed high levels of miRNA-21 compared with normal human (P<0.05). The expression level of miRNA-21 in middle-late stage (Ⅲ+Ⅳ) of colorectal cancer tissues was significantly higher than early stage(Ⅰ+Ⅱ) (P<0.05). The expression level of miRNA-21 in poorly differentiated tumor tissues was significantly higher than middle-high differentiation (P<0.05). The expression level of miRNA-21 in colorectal cancer with lymph node metastasis was significantly higher than those without lymph node metastasis (P<0.05). Conclusion Increased expression of miRNA-21may be involved in the development of colorectal cancer, and miRNA-21 may be the potential tumor marker of colorectal cancer. It might provide a new way of thinking for colorectal cancer early screening and diagnosis.

[Key words]Colorectal cancer；Fecal；miRNA-21；Magnetic cell sorting

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，根据2014年美国癌症协会最新数据表明，结直肠癌的发病率和死亡率都排在所有肿瘤的第3位[1]；近年来，随着我国生活条件和饮食习惯的改变，结直肠癌发病率和死亡率呈明显上升趋势，而早期发现结直肠癌及其癌前病变是降低结直肠癌死亡率的关键[2]。近年研究显示，微小RNA(miRNA)在多种肿瘤的发生、演进、侵袭、转移和血管生成中扮演了重要角色，并可能与结直肠癌的发生、发展相关[3]，提示miRNA 可能在结直肠癌的早期诊断及治疗中具有潜在的临床价值。本研究通过免疫磁珠技术从人粪便中分离出脱落细胞，并用实时荧光定量(RT-qPCR)技术检测miRNA-21在结直肠癌患者和正常人中的表达水平，分析其与临床病理因素的关系，初步探讨miRNA-21在结直肠癌中的作用及临床意义。

1材料与方法

1.1一般资料收集2014年5月至2014年7月间广西医科大学结直肠肛门外科收治病理诊断明确的30例结直肠癌患者粪便标本，其中男19例，女11例，结肠癌13例，直肠癌17例，年龄41~68岁之间，平均61.7岁，另采集10例健康志愿者粪便作为对照组。所有患者术前均未行放化疗或免疫治疗，标本采集后迅速放入液氮中，-80℃保存，备用。

1.2材料免疫磁珠(Dynal公司，型号 M-450)，Trizol 试剂(Invitrogen，美国)、DEPC水(Promega，美国)、mirVana miRAN Isolation Kit(Ambion，美国)，Poly(A)Tailing kit(Ambion，美国)、琼脂糖(Promega，美国)，Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR Quantitation Kit(苏州吉玛基因股份有限公司)，磁性分离器(Dynal公司，型号MPC-1)，ABI-7300 实时荧光定量仪(ABI公司，美国)，使用软件Primer-Express 2.0进行引物与探针的设计；内参照RNU6B上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，扩增产物长96 bp；miRNA-221上游引物5'-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3'，下游引物为5'-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3'，扩增产物长73 bp，上述引物均由上海生工合成。

1.3实验方法

1.3.1免疫磁珠法分离粪便脱落细胞粪便标本按1 mL/g用40 mL Hanks缓冲液(含10% FBS，25 mmol/L的HEPES液)重悬，混匀，200 rpm，离心1 min，吸取上层匀浆，用512 μm孔大小的尼龙滤网过滤，滤液加80 μL免疫磁珠，室温，孵育30 min，使用Dynal MPC-1磁性分离器将细胞-磁珠复合物与溶液分离，收集分离出的脱落细胞，-80℃保存，备用。

1.3.2加尾及反转录根据Poly(A)Tailing Kit试剂盒的说明书对总RNA进行polyA加尾反应30 min。经过氯仿苯氛抽提，乙醇沉淀RNA，抽提纯化出加尾后的RNA。根据Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR QuantitationKit 试剂盒的说明书，对RNA进行反转录。反应体系是20 μL，首先将1 μL RNA、1 μL RT-primer、1 μL dNTp混合物及DEPC水配成10 μL体系，在65℃孵育5 min，然后将包含2 μL 10x RT缓冲液，4 μL MgCl2，2 μL 0.1 MDTT，1 μL RNase OUT和1 μL SuperScript Ⅲ RT共10 μL的反应体系加入，混匀，50℃ 50 min，85℃ 5 min，最后加入1 μL RNaseH 37℃，20 min后，收集反转录产物。

1.3.3总RNA纯度和完整性检测使用紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度及纯度。用RNA完整指数(RNA 1ntegrity number，RIN)衡量总RNA的质量，该值从1~10分别反应样本的质量。RIN=7~10表示为质量好，RIN=5~7表示为质量中，若RIN<5则表示质量差。

1.3.4RT-qPCR检测以反转录获得的cDNA为模板，进行RT-qPCR，反应条件：94℃ 5S，58℃ 20S，72℃ 30S，45个循环，在Rotor-gene6000荧光定量PCR仪上检测miRNA-21的表达水平。以RNU6B作为内参标定目标miRNA的表达量，计算方法为2-△△CT相对定量法。每个标本设三个平行管，重复三次。

2结果

2.1粪便miRNA-21RT-qPCR结果显示在结直肠癌患者粪便miRNA-21的表达水平为3.58±0.30，正常人则为1.00±0.13，两者间比较，经检验t=25.95，P=0.000，差异有统计学意义。

2.2结直肠癌患者粪便miRNA-21表达水平与临床病理因素的关系根据临床病理因素的不同对结直肠癌患者进行分组比较，结果显示：Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者miRNA-21的表达水平要高于Ⅰ+Ⅱ期结直肠癌患者，P<0.05；低分化患者高于中高分化者P<0.05；有淋巴结转移患者明显高于无淋巴结转移者，P<0.05，见表1。

表1粪便miRNA-21表达水平与临床病理因素的关系

NmiRNA-21表达水平tP年龄 <60163.66±0.44 ≥60143.51±0.231.6170.111性别 男193.64±0.28 女113.56±0.390.8370.406部位 结肠133.59±0.25 直肠173.67±0.371.9470.056TNM分期 Ⅰ+Ⅱ143.45±0.22 Ⅲ+Ⅳ163.97±0.464.3520.000分化程度 高中分化243.51±0.25 低分化63.71±0.402.4410.018远处器官转移 有53.72±0.39 无253.45±0.263.0530.003CEA ≤5ng/mL173.54±0.33 >5ng/mL133.67±0.281.6520.104

3讨论

miRNA是新发现的一类含有21～25个核苷酸的非编码小分子单链RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因的3′UTR 区部分互补，抑制转录产物的翻译，从而调控靶基因的表达，影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程[4、5]。目前研究人员在许多肿瘤中己经发现了比较特异性的miRNA，并尝试用这些miRNA作为肿瘤的诊断标志物[6~10]。马钦[11]等研究显示has-miR-182、has-miR-17、has-miR-106a、has-miR-93、has-miR-200c、has-miR-92a、has-let-7a、has-miR-20a等8个miRNA 在肿瘤组织中显著上调。张益[12]等运用实时定量PCR技术对100个早期结肠癌标本和正常黏膜标本中的miRNA-21的表达进行检测，结果发现在结肠癌标本中miRNA-21的表达要高于正常黏膜，且rniRNA-21过表达预示结肠癌患者预后较差和较低的生存率。邱实[13]等则发现结直肠癌患者血浆及癌组织中的miRNA-21表达升高。目前，有关结直肠癌的miRNA研究标本大多来自结直肠组织或血浆，肿瘤细胞株培养，而以粪便miRNA作为肿瘤分子标志物的研究较为少见。随着粪便脱落细胞分离和收集技术的发展，检测粪便结直肠脱落细胞已成为目前非侵袭性结直肠癌筛检技术的研究热点之一。

miRNA-21是在人类组织中发现较早、研究比较多的miRNA，现已发现在胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中存在明显的上调[6~10]，因此认为其在肿瘤发生过程中发挥类癌基因作用。在本研究中我们利用免疫磁珠技术成功地从少量粪便中分离出纯度较高的目的脱落细胞，并用实时荧光定量PCR技术检测结直肠患者和正常人粪便中的miRNA-21的表达，结果显示结直肠癌患者粪便miRNA-21的表达水平要显著高于正常人(P<0.05)，提示miRNA-21的表达可能参与了结直肠癌的发生、发展。我们进一步根据患者临床病理因素的不同对结直肠癌患者进行分组比较，结果显示Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者粪便miRNA-21的表达水平要高于Ⅰ+Ⅱ期结直肠癌患者(P<0.05)；低分化患者高于中高分化者(P<0.05)；有淋巴结转移患者明显高于无淋巴结转移者(P<0.05)，提示miRNA-21可能参与了结直肠癌肿瘤的进展，miRNA-21表达的升高是结直肠癌的不良事件。包龙龙等[14]的研究发现，miR-21 通过蛋白激酶 B/细胞外信号调节激酶途径促进肝癌肿瘤细胞的侵袭与转移。此外，Ma[15]等人认为miR-21表达水平的下调，具有促进肿瘤细胞凋亡、减少转移和浸润的作用，同时有研究表明，miR-21激活转录因子-4和转化生长因子β受体2，从而诱导结直肠癌细胞的增殖和浸润[16、17]本次研究与以上结果相符。

综上所述，结直肠癌粪便miRNA-21表达的升高可能参与了肿瘤的发生、发展，miRNA-21的表达水平与肿瘤的临床病理指标相关，其表达水平的变化可反应结直肠癌患者病情的进展程度。因此，粪便miRNA-21可能成为结直肠癌潜在的肿瘤标记物，为结直肠癌的早期筛查、诊断提供了新的思路。

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