李东 黄晓翔 袁捷 俞哲元 徐梁 徐海淞 韦敏

Periostin对自体脂肪移植成活率的影响

李东 黄晓翔 袁捷 俞哲元 徐梁 徐海淞 韦敏

目的 探索Periostin复合自体脂肪颗粒移植后，对移植脂肪血管化及成活率的影响，以明确Periostin在自体脂肪移植中的作用。方法 体外实验验证低氧条件下Periostin对脂肪干细胞成血管的影响，RT-PCR检测CD133及CD144的基因表达情况；将Periostin复合自体脂肪组织移植到裸鼠体内，观察移植脂肪的成活情况。结果 在低氧条件下，Periostin组细胞成血管能力明显优于空白对照组；RT-PCR检测结果显示，Periostin组的CD133和CD144表达量明显高于空白对照组；Periostin复合自体脂肪移植后1、3、6个月，移植脂肪成活率分别为79.50%±3.70%、67.71%±4.08%和64.78%±5.78%，明显高于对照组（51.83%±5.97%、39.45%±10.32%和34.20%±10.61%）。结论 Periostin能够改善脂肪移植早期组织对缺氧的耐受性，促进自体脂肪颗粒移植后的早期血管化，有利于移植脂肪颗粒的存活，可有效改善脂肪移植的成活率。

脂肪移植 成活率 低氧 骨膜蛋白

各种畸形、创伤、肿瘤切除等造成的机体软组织缺损，严重影响患者的身心健康，对其进行修复和重建是整复外科的重要内容[1-2]。自体脂肪组织作为软组织填充材料，具有来源充足，获取简单，供区创伤较小，不产生免疫排斥等优点。但是，自体脂肪移植术后常出现脂肪的吸收、感染、液化坏死、钙化以及囊肿等并发症[3-4]，导致移植脂肪成活率低下，严重限制了自体脂肪移植的临床应用。

目前，普遍认为导致移植脂肪组织成活率低的最主要因素是移植微环境的缺血缺氧[1]，文献报道指出，脂肪组织对低氧刺激十分敏感，如果氧分压持续低于其所能耐受的最低值，脂肪组织细胞很快就会死亡[5]，从而导致多种并发症。

Periostin（骨膜蛋白），是一种分泌型的细胞外基质蛋白，可以为细胞的生存提供微环境。有研究表明，Periostin能抑制低氧、低营养等应激状态诱导的内皮细胞的凋亡[6]。此外，Periostin还与内皮细胞迁移的趋化性和趋触性密切相关[7]。本研究探索Periostin复合自体脂肪颗粒移植后对移植脂肪血管化及成活率的影响，明确Periostin在自体脂肪移植中的作用。

1 材料及方法

1.1 实验试剂及器材

DMEM低糖培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清，0.25%胰蛋白酶 （GIBCO，美国）；恒温CO2培养箱（Forma Scientific，美国）；无菌超净工作台（上海博讯实验器材有限公司）。

1.2 实验动物

先天性无胸腺小鼠30只，4～6周龄，雄性（我院实验动物中心提供）。

1.3 脂肪来源

脂肪来源于健康的吸脂患者，女性，年龄22～41岁，均获患者知情同意。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪干细胞的分离培养

获取的脂肪PBS洗涤2～3遍，修剪成1 mm3大小的颗粒，加入等体积的1.5 mg/mL NB4胶原酶，于37℃恒温摇床上消化60 min，消化后离心、重悬过滤，并接种于培养皿；根据生长情况定期传代，细胞纯化后对其干性进行鉴定。

1.4.2 Periostin在低氧条件下对脂肪干细胞的成血管作用的影响

制备培养基，分别为100 ng/mL Periostin蛋白组、50 ng/mL VEGF因子组（阳性对照组）和空白对照组；将细胞接种到含matrigel的24孔板，37℃低氧培养箱中培养；每3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录，对各组成血管情况进行统计分析。

1.4.3 Periostin对脂肪干细胞基因表达的影响

低氧细胞培养及匀浆液制备：低氧培养10 d后，去上清，加入Trizol细胞裂解液，每10 cm2面积加1 mL，裂解细胞，制备细胞匀浆；提取RNA并行RTPCR检测，检测CD133及CD144的基因表达情况。

1.4.4 Periostin对自体脂肪移植成活率的影响

将抽脂获取的脂肪颗粒洗净，剪碎后分别与Periostin（Periostin组）及VEGF（VEGF组，阳性对照组）混合，并设立空白对照组；将实验鼠麻醉后，用18号针头将1 mL脂肪颗粒移植到实验鼠皮下，局部按压3～5 min，表面涂抹红霉素眼膏；术后单独分笼饲养，防止相互撕咬。术后第2天，观察裸鼠的成活及伤口情况。术后不同时间点取材，排水法检测存留的脂肪体积，动态观察各组移植脂肪的成活情况。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，成管的数目、基因表达变化、术后存活率的比较采用t检验及方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪干细胞的形态学观察

人脂肪干细胞经胶原酶消化后接种培养，2～3 h后可有少量细胞贴壁，传代培养至第3代后镜下观察，脂肪干细胞呈形态均一的长梭形，细胞呈旋涡状生长，放射状排列，细胞状态良好。细胞经干性鉴定为脂肪干细胞（图1、2）。

图1 脂肪干细胞的形态学观察（标尺：50 μm）Fig.1 Morphology of adipose stem cells(Scale:50 μm)

图2 多向诱导分化潜能（标尺：50 μm）Fig.2 The potential ability of multi-differentiation (Scale:50 μm)

2.2 Periostin对ASC细胞成血管的影响

镜下可见，随着诱导时间的延长，各组成血管差异越来越明显。3 d时部分细胞团块有“出芽”现象，以Periostin组及VEGF组出芽现象最为明显，而空白对照组的出芽现象尚不明显。9 d时，Periostin组相互之间的网络状连接较VEGF组更为发达，说明在重组蛋白Periostin的诱导刺激下，脂肪干细胞的成管能力较强（图3）。

图3 低氧条件下各组成血管情况（40×）Fig.3 The condition of tabulation in each group under hypoxia(40×)

统计发现，Periostin及VEGF组在低氧条件下诱导ASC成血管的能力较空白对照组更强，其中Periostin在第9天诱导成血管形成的网络状结构强于 VEGF阳性对照组 （P<0.05），而 Periostin及VEGF组均明显强于空白对照组（P<0.05）（图4）。

图4 低氧条件下ASCs成血管统计（*：P<0.05，vs空白对照组；#：P<0.05，vs Periostin组）Fig.4 The statistics of tabulation of ASCs under hypoxia (*:P<0.05,vs blank control group;#:P<0.05,vs Periostin group)

2.3 Periostin对ASCs基因表达的影响

低氧条件诱导7 d后，RT-PCR检测CD133（内皮祖细胞相关抗原）、CD144（成熟内皮细胞相关抗原）基因表达发现，CD133及CD144在Periostin组的表达量与VEGF阳性对照组相当（P>0.05），在空白对照组的表达量最低（P<0.05）（图5）。

图5 低氧诱导后各组CD133、CD144基因表达Fig.5 Gene expression of CD133 and CD144 in each group under hypoxia

2.4 移植脂肪的大体形态观察及存活率分析

术后不同时间点取材观察移植脂肪的大体形态，各组移植脂肪的体积变化呈一定的规律性。一般在移植术后早期，移植脂肪区域表现为体积略有增大，为炎性肿胀，随着炎性肿胀的消退，移植脂肪的体积逐渐变小，此为脂肪组织被吸收的表现。

移植术后2周，不同组别移植脂肪的体积差异较大。单纯脂肪颗粒组（空白对照）吸收较明显，而Periostin+脂肪颗粒移植组，VEGF+脂肪颗粒组吸收相对缓慢，但均有不同程度的液化坏死；移植术后4周，单纯脂肪颗粒组残留脂肪体积最小，伴有较明显的液化坏死，其他两组吸收程度轻并未见明显的液化坏死（图6）。

图6 移植脂肪组织的大体形态Fig.6 General observation of transplanted adipose tissue

图7 移植脂肪的成活率Fig.7 The survival rate of transplanted fat

脂肪移植术后不同时间点取材，立即用排水法测量术后存留的脂肪体积。移植术后1、3、6个月，单纯脂肪颗粒组脂肪存活率分别为51.83%±5.97%、39.45%±10.32%和34.20%±10.61%；Periostin复合脂肪颗粒移植组成活率分别为 79.50%±3.70%、67.71%±4.08%和64.78%±5.78%；VEGF复合脂肪颗粒移植组的成活率分别为68.33%±4.50%、52.86%± 6.37%和49.71%±7.76%。上述结果采用单因素方差分析比较，结果显示，术后1、3、6个月，三组之间比较，两两之间均有显著差异（P<0.05）（图7）。

3 讨论

目前有关自体脂肪移植的报道均认为脂肪移植后易出现不同程度的液化坏死[8-13]，大多数移植脂肪组织液化坏死都是由于移植后缺血缺氧导致的[5]。因此,我们试图改善脂肪移植后缺血、缺氧的情况，并提高移植组织对低氧的耐受性，以促进移植脂肪的成活。

为明确Periostin在低氧条件下诱导脂肪干细胞的成血管作用，本实验首先分离培养脂肪干细胞并行干性鉴定，然后将脂肪干细胞接种在已铺matrigel的24孔板中，并于低氧条件下培养，定期观察。结果发现，培养第3天空白对照组、Periostin组及VEGF组三者无明显差异。我们认为这是因为细胞在低氧环境下适应需要一个过程，因此各个组别的差异并不显著。在随后的观察中发现，随着时间的延长，Periostin组、VEGF组的细胞相互连接形成了更多的不同大小管腔的网络状结构，其中Periostin组成血管的数目更多。说明Periostin与VEGF一样，具有在低氧条件下促进人脂肪干细胞形成血管的功能。随着低氧诱导时间的延长，Periostin组的细胞耐受缺氧的能力逐渐表现出来，说明在体外条件下，Periostin的确能够提高细胞对缺氧的耐受性，同时具有促进脂肪干细胞形成血管的能力。

RT-PCR检测血管内皮细胞相关抗原CD133、CD144基因表达。结果发现，Periostin组、VEGF组的CD133、CD144表达量均高于空白对照组。这说明Periostin及VEGF能够有效促进血管内皮细胞相关抗原的表达，其对促进脂肪干细胞向血管内皮细胞转化具有积极作用。

以上体外实验的结果提示，在低氧条件下，Periostin有助于提高脂肪干细胞对缺氧的耐受性，可以促进脂肪干细胞向血管内皮细胞转化并成血管，达到甚至超过了VEGF阳性对照组的效果。

通过进一步的体内实验，我们发现Periostin能够有效提高移植脂肪的成活率，其作用可能是通过提高移植早期组织细胞对低氧的耐受性和促进移植脂肪的血管化来实现的。本实验研究结果对于提高移植脂肪的成活率具有重要意义，亦可推广应用于低氧或缺血引起的各种病理状态。但是其具体机制有待于进一步深入研究。

4 总结

本实验证实Periostin能够促进移植脂肪的成活，可能是通过促进移植脂肪的血管化和提高了组织细胞对移植后低氧的耐受性两方面实现的。Periostin作为促进移植脂肪成活的新的因子，对其进行深入研究具有重要的临床应用价值。

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Effect of Periostin on the Survival Rate of Autologous Fat Transplantation

LI Dong,HUANG Xiaoxiang,YUAN Jie,YU Zheyuan,XU Liang,XU Haisong,WEI Min.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:WEI Min (E-mail:drweimin@163.com).

Objective To explore the effect of Periostin on the vascularization and survival rate of autologous fat transplantation,and to find out the role of Periostin in autologous fat transplantation.Methods The special effect of Periostin in inducing vascularization of adipose stem cells under hypoxia was observed in vitro.The expression of CD133 and CD144 of ASCs under hypoxia were tested by RT-PCR.Then,the adipose tissue compounded with Periostin was transplanted into nude mice,and the survival rate of the transplanted fat tissue was detected at different time points after transplantation. Results Periostin group showed a higher vascularization degree under hypoxia,compared with blank control group.The expression of CD133 and CD144 of ASCs under hypoxia in Periostin group were higher than in blank control group.Periostin composite with autologous fat transplantation improved the survival rate of fat transplantation at each time point(79.50%± 3.70%,67.71%±4.08%,64.78%±5.78%),which were better than simple autologous fat transplantation (51.83%±5.97%, 39.45%±10.32%,34.20%±10.61%).Conclusion Periostin is able to improve fat survivability under hypoxia during the early stage,and promote the early stage vascularization of autologous fat granules after transplantation,which is beneficial to the survival of the transplanted fat tissue.

Fat transplantation;Survival rate;Hypoxia;Periostin

R622+.9

A

1673－0364（2015）06－0358－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.06.003

2015年8月9日；

2015年9月27日）

国家自然科学基金（81471886）；上海市科委重点项目（134119a2000）。

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

韦敏（E-mail：drweimin@163.com）。