张 萍，贾国东，魏 萍

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

益生菌具有抗致病微生物的作用已经得到普遍认识，其菌群中特别是嗜酸乳杆菌具有较明显的抗致病微生物性质[1]。S层蛋白是嗜酸乳杆菌表层重要的蛋白质，有保护菌体维持形状、作为物质交换的分子过滤筛、参与细胞识别与粘附等功能，而且是菌体适应周围环境的重要结构，S层蛋白具有粘附小肠上皮细胞的特性，是肠道内益生菌定植不可或缺的结构[2-4]。为了证实S层蛋白在菌体发挥抗病毒功能中的作用程度,评价嗜酸乳杆菌抑制病毒感染宿主细胞的能力，本试验以嗜酸乳杆菌为益生菌的代表，评价与研究S层蛋白在抗病毒作用中的参与程度以及作用原理，以期为益生菌的后续研究提供最基础的理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种 嗜酸乳杆菌（La-A），毒株:新城疫IV系疫苗毒（LaSota 株），东北农业大学传染病教研室保存。

1.2 NDV的细胞毒力测定 采用Reed-Muench 法测定两种病毒各自的半数组织感染量（TCID50）。

1.3 嗜酸乳杆菌试验前处理

1.3.1 菌体活化 试验时经MRS平板活化后，37 ℃培养21～24 h，连续转接3 代。

1.3.2 益生菌生长曲线的测定 将完成活化菌株按0.1 mL/管的接种量分别接于11 支盛有10 mL MRS液体培养基的试管中，测其600 nm 处的光密度值（OD600值）。

1.3.3 嗜酸乳杆菌药敏试验 结果参照文献：1 000 U/mL 的庆大霉素能显著抑制此菌的生长。

1.3.4 菌体的细胞毒性测定 将已处理好的不同浓度活菌体加入已长成单层的96 孔细胞培养板中，置温箱中培养90 min，之后弃去孔中液体，再加入含有1 000 U/mL 庆大霉素细胞维持液继续培养。按时观察细胞病变（CPE）情况，测定细胞活性得到其最大无毒剂量。

1.4 S层蛋白对IEC毒力的测定 将蛋白按照以下浓度梯度用细胞维持液稀释0.2 mg/mL，0.3 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL，0.6 mg/mL，0.7 mg/mL，0.8 mg/mL，0.9 mg/mL，1.0 mg/mL 加入待检细胞。按时观察细胞病变（CPE）情况，测定细胞活性得到其最大无毒剂量。

1.5 嗜酸乳杆菌不同成分抗NDV感染IEC作用研究 试验分3 种处理如下：（1）预防性试验。预先将每个试验组成分以0.1 mL 量分别孵育细胞90 min，后以100 TCID50/0.1 mL 的病毒量接入细胞孔0.1 mL，再次孵育90 min，洗涤后加入细胞维持液继续培养；（2）治疗性试验。以100 TCID50/0.1 mL 的病毒量0.1 mL 接入细胞孔与细胞孵育90 min，后加入0.1 mL 每个试验组继续孵育90 min，之后洗涤加入细胞维持液继续培养；（3）混合感作试验。将各个试验组分别与100 TCID50/0.1 mL的病毒等体积孵育90 min，之后共同接入细胞，继续孵育90 min，之后洗涤加入正常维持液培养。用MTT 方法检测各组细胞活力。

1.6 检测S层蛋白与牛血清白蛋白对NDV的粘附能力 用常规ELISA方法进行检测S层蛋白与牛血清白蛋白对NDV的粘附能力，测定OD490nm 值。

1.7 S层蛋白与牛血清白蛋白抗病毒感染IEC将各个试验组分别与100 TCID50/0.1 mL 的病毒等体积孵育90 min，之后共同接入细胞，继续孵育90 min，之后洗涤加入正常维持液培养孵育。S层蛋白稀释度与白蛋白稀释度0.1～1.0 mg/mL。

2 结果

2.1 NDV的细胞毒力测定结果 用Reed-Muench法计算得NDV毒力为10-3.85TCID50/0.1 mL。

2.2 嗜酸乳杆菌生长曲线

2.2.1 嗜酸乳杆菌生长曲线 试验选取其进入稳定期21 h 为收获菌体时间点。

2.2.2 嗜酸乳杆菌的最大无毒剂量结果 通过观察细胞CPE 变化程度，得出嗜酸乳杆菌最大无毒剂量为1011CFU/mL。

2.3 嗜酸乳杆菌不同成分抗NDV感染IEC作用试验结果与分析 表1 数据显示，菌体对抑制病毒的抑制率随浓度升高而增强，108CFU/mL 浓度时最高抑制性。

表1 菌体不同接入顺序对NDV抑制率的组间比较（平均值±标准差）

表2 数据可见，脱S层蛋白菌体对病毒依然具有抑制性，治疗试验对病毒的抑制率极显著的低于其他两组，混合感作试验比预防试验组的病毒抑制率显著性增强。

表2 脱S层蛋白菌体不同接入顺序对NDV抑制率的组间比较（平均值±标准差）

表3 数据中S层蛋白最强作用浓度0.8 mg/mL，其中在每组浓度数据中，0.7～1.0 mg/mL 组的混合感作试验抑制病毒效果显著性高于预防组、极显著高于治疗组；0.3～0.6 mg/mL 组中混合感作组抑制病毒率显著高于预防组，极显著高于治疗组。

表4 数据显示，2、4、6 倍稀释液的病毒抑制率中，混合感作试验显著强于预防组，极显著强于治疗组；8、10 倍稀释液的病毒抑制率中，预防组与混合感作组作用相当，都显著强于治疗组；12倍的抑制率三者均较低，作用强度无显著差异。

2.4 S层蛋白和牛血清白蛋白对NDV粘附能力试验结果 表5 数据显示，S层蛋白和牛血清白蛋的组间比较（平均值±标准差）白对NDV粘附量均随蛋白浓度增大而增加，S层蛋白对病毒的粘附性稍强于白蛋白对病毒的粘附。

表3 S层蛋白不同接入顺序对NDV抑制率

表4 菌体培养上清液不同接入顺序对NDV抑制率的组间比较 （平均值±标准差）

2.5 S层蛋白与牛血清白蛋白抗病毒感染IEC试验结果 经混合感作方式试验得出S层蛋白在浓度0.6 mg/mL 时的抑制NDV能力为0.826±0.022Aa，而同浓度下白蛋白为0.196±0.018Bb。由此可见，S层蛋白在此浓度下抑制病毒能力显著高于白蛋白。

表5 S层蛋白和白蛋白粘附性

3 讨论

活菌体主要是通过占位作用、粘附病毒、封闭细胞表面病毒受体和改善细胞自身状态来发挥其抗病毒作用的。从试验结果来看，S层蛋白对NDV抑制率最大达到88.9%，脱S层蛋白菌体对NDV抑制率最大达到48.9%，由此可见，S层蛋白在嗜酸乳杆菌抗病毒作用中发挥了重要的作用。通过粘附试验可以看出，S层蛋白具有对肠上皮细胞的粘附能力，既是嗜酸乳杆菌定植的关键蛋白，又具有对一些病毒的粘附能力从而降低病毒的感染。在预防试验和治疗试验的结果可以看出，菌体成分预防试验和混合感作试验的两种病毒抑制率都高于治疗试验，说明当病毒感染细胞，益生菌成分无法起到明显的抑制病毒增殖性质。菌体在代谢过程中产生大量的次级代谢产物，如细菌素、维生素、多糖、小分子肽类及酸性代谢产物等等。在这些成分的刺激下可以抑制病毒活力，影响病毒对宿主细胞的粘附，还可以提高宿主细胞的自身免疫功能水平，综合起到抑制病毒感染宿主细胞的作用。通过以上试验可以看出，菌体对病毒的抑制作用是多方面共同发挥的结果，本试验仅是建立了鸡原代培养的肠上皮细胞作为平台，进行了菌体抗病毒的初步探索，对S层蛋白抗病毒的具体机制还需要深入研究。

[1]潘渠，胡福泉.S层蛋白质的功能和应用[J].生命的化学，2006，26（4）：318-321.

[2]王占锋.鸡胚肠组织细胞培养及益生菌抗NDV作用研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2010.

[3]Garrote G L，Delfederico L，Bibiloni R，et al.Lactobacilli isolated from kefir grains：evidence of the presence of S-layer proteins[J].Journal of dairy research，2004，71（2）：222-230.

[4]Smit E，Oling F，Demel R，et al.The S-layer Protein of＜i＞Lactobacillus acidophilus＜/i＞ATCC4356：Identification and Characterisation of Domains Responsible for S-protein Assembly and Cell Wall Binding[J].Journal of molecular biology，2001，305（2）：245-257.