周 勇，白文顺，杨亮宇，张 健，孙亭亭，陈培富

（云南农业大学，云南 昆明 650201）

马立克病（Marek's Disease，MD）是鸡的一种淋巴细胞增生性肿瘤病，对养鸡业的健康发展危害很大。已有研究表明，鸡主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）的B-F和B-L 基因是MD抗性主效基因，其中单倍型B1、B4、B5、B12、B13、B15、B19 和B23 对MD较易感，B2、B6、B14 和B17 对MD有弱抗性，B21 对MD抗性最强[1]。目前，针对武定鸡抗MD的研究还未见报道。本研究通过对20 个武定鸡试验鸡群进行MHC-B单倍型分型，并通过测序分析和攻毒试验确定武定鸡特有的抗MD基因多态性位点，筛选出抗MD的试验鸡群，为培育武定鸡抗MD品系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 选用购自云南省武定、禄劝等地的武定鸡；MDV京-1 株由北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供；全基因组DNA提取试剂盒，2×TaqPlus PCR Master Mix，购自TIANGEN 公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司。引物参考Fulton 等[2]在微卫星LEI0258 和MCW0371 位点处设计，由北京六和华大基因科技公司合成，引物序列如表1。

表1 LEI0258和MCW0371引物

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 随机选取120 日龄以上总数约2 000 只的20 个武定鸡群，对每个鸡群20%左右（10～40 只）试验鸡沿翅下静脉采血，共400 只，保证各鸡群采血鸡公母各半。

表2 LEI0258和MCW0371的PCR目的产物与各标准单倍型

1.2.2 PCR 扩增微卫星等位基因 血细胞DNA按TIANGEN 试剂盒操作说明书进行提取，并作为模板进行PCR 扩增，反应体系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Mix 12.5 μL，补ddH2O至25 μL；反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，57.2 ℃（LEI0258 引物）或59 ℃（MCW0371 引物）退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 B单倍型分型 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，结合表2 判定B单倍型[3]。将LEI0258 引物扩增的MD抗性与易感性单倍型纯合子PCR 产物进行胶回收后送北京六和华大基因科技公司测序，测序结果比对GenBank 下载的标准B单倍型序列，以验证分型的准确性并分析基因多态性。

1.2.4 雏鸡攻毒试验及抗MD品系的选育 将发现的MD抗性相关B单倍型纯合子亲本进行杂交，其F1 代雏鸡（10 日龄）均不进行MD疫苗接种，按不同单倍型分为攻毒组和对照组，5 羽/单倍型。攻毒组每羽腹腔注射经10 倍稀释MDV京-1 株0.3 mL；对照组每羽腹腔注射生理盐水0.3 mL。记录发病与死亡情况，死亡鸡及时剖检，未死亡鸡到90 日龄再全部剖检，筛选MD发病率和死亡率最低的B单倍型纯合子亲本鸡。

2 结果

2.1 PCR 扩增结果 微卫星LEI0258 扩增获得目的片段包括193、205、249、261、295、309、345、357、393 bp 和443 bp（图1.A）；微卫星MCW0371扩增获得目的片段包括201、202、203、205、206 bp和209 bp（图1.B）。

2.2 B单倍型分型与序列分析结果

图1 武定鸡LEI0258（A）和MCW0371（B）PCR扩增电泳分析

2.2.1 单倍型分型 试验鸡B单倍型分布情况（图2），分析发现，MD易感单倍型占19.5%、弱抗占15.4%、抗性占17.9%，但出现频率最高的B11及其余单倍型对MD有无抗性尚未知[2]。同时母鸡组中发现B5/B5 试验鸡2 只，B11/B11 39 只，B14/B14 和B15/B15 各3 只，B21/B21 7 只，3 只不确定是否为单倍型纯合子；公鸡组中发现B5/B5 10只，B6/B6 1 只，B11/B11 27 只，B14/B14 5 只，B15/B15 2 只，B21/B21 8 只，2 只不确定是否为纯合子。

2.2.2 微卫星LEI0258 等位基因序列分析 部分MD抗性与易感单倍型纯合子序列通过DNAStar 软件分析，发现DNA测序结果与应用微卫星扩增对单倍型分型结果一致（图3）。同时发现，MD抗性与易感单倍型在193～230 bp“TTCTTTCTTTCC”重复单元存在个数上的差异，易感单倍型在230～266 bp 由标准的“TTCTTTCTTTCC”部分变为“GGATTTTGAGCC”、“AAAAAAATCACC”或“ACAAAATGAGCC”，样品3 和4 与MD易感单倍型B5 和B15 在237～240 bp由“GAGG”变为“TGAG”。

2.3 试验鸡攻毒结果及抗MD品系的初步筛选攻毒组B5/B5、B15/B15、B11/B11 试验鸡发病率分别为100%、100%、80%，死亡率分别为100%、80%、60%；B14/B14 和B21/B21 发病率为40%和20%，但无死亡。攻毒组发病鸡剖检发现心脏、肾脏、脾脏均有不同程度肿大，心脏、脾脏、肝脏表面都有明显的白色肿瘤，肾脏出现花斑肾，剩余鸡剖检均无MD症状（图4）；对照组没有发现MD症状及病理变化，也无死亡鸡出现。攻毒试验结果发现B21/B21 对MD抗性最强，因此母鸡组中7 只B21/B21 试验鸡和公鸡组中8只B21/B21试验鸡，可作为武定鸡抗MD品系。

图2 试验武定鸡单倍型分布情况

图3 武定鸡微卫星LEI0258等位基因序列分析截

3 讨论

鸡MHC与MD抗性密切相关，如无特定病原体BW/G（n）系鸡群是通过检测微卫星LEI0258、MCW0371、MCW0312 和MHC-D等位基因并筛选纯合子建立而成[3]。本研究通过检测LEI0258 和MCW0371 等位基因对武定鸡进行单倍型分型，发现B1、B5、B6、B11、B13、B14、B15、B17、B21、B22和B27 等单倍型，特别是B21/B21 在试验公鸡和母鸡中都存在，非常利于培育武定鸡抗MD品系。由于大小相同的微卫星等位基因可能存在差异[3]，本研究对部分微卫星LEI0258 等位基因序列测定，验证了PCR 扩增分型的正确性，同时发现武定鸡在此遗传位点特有的基因多态性。攻毒试验进一步验证B21 单倍型对MD抗性最强，且发现B11 单倍型对MD较为易感，提示武定鸡总体上属于MD易感品种。鸡MHC基因在进化过程中相对稳定[4]，对B21/B21 试验鸡扩大种群可建立一个武定鸡抗MD品系。

[1]Gao CX，Han L X，Qu L D，et al.Specific TaqMan probed real-time quantitative RT-PCR methods and their application to differentiate the transcripts of duplicated B-F or B-L-Bgenes in chicken MHC[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2012，145（3-4）：590-596.

[2]Fulton JE，Juul-Madsen H R，Ashwell CM，et al.Molecular genotype identification of the Gallus gallus major histocompatibility complex[J].Immunogenetics，2006，58（5-6）：407-421.

[3]Sironi L，Williams JL，Stella A，et al.Genomic study of the response of chicken to highly pathogenic avian influenza virus[J].BMCProceedings，2011，5（Suppl 4）：S25.

[4]Kaufman J.Antigen processing and presentation：Evolution from a bird's eye view[J].Molecular immunology，2013，2（55）：159-161.