陈 娜，苏建荣，丁军颖，洪燕英

混合菌感染多由于创伤性诊疗方法如气管插管、气管切开等应用，广谱抗生素过度使用，加之患者有严重的基础疾病、机体免疫系统功能低下而造成的两种或两种以上致病菌或条件致病菌引起的感染［1-2］。如某种抗菌药物能对两种或两种以上混合菌同时起抗菌作用，就可以减少应用多种抗菌药物治疗混合菌感染而造成的多种抗菌药物耐药性的产生。经统计，混合菌感染组合以大肠埃希菌和屎肠球菌混合感染为主［3］，同时对这两种混合菌起抗菌作用的常用抗菌药物有氨苄西林、环丙沙星和左氧氟沙星，而环丙沙星和左氧氟沙星仅用于泌尿系统感染的补充试验抗菌药物，氨苄西林属于常规首选药敏试验抗菌药物。所以氨苄西林耐药将会导致不得不应用多种抗菌药物来治疗混合感染，也就会造成对多种抗菌药物的耐药性。因此细菌对氨苄西林的耐药情况就显得尤为重要。统计结果显示，大肠埃希菌是参与混合感染最多的细菌，其对氨苄西林耐药的机制主要是β-内酰胺酶的产生，对于单一菌感染大肠埃希菌的β-内酰胺酶国内外已有较详细的研究，而针对混合菌感染中氨苄西林耐药的大肠埃希菌的β-内酰胺酶报道较少。现就对大肠埃希菌和屎肠球菌混合感染中氨苄西林耐药的大肠埃希菌的β-内酰胺酶基因报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪(法国生物梅里埃公司)，聚合酶链反应(PCR)扩增仪(Bio-rad c-100美国)，凝胶成像仪(Tanon 1600美国)。血琼脂平板培养基(天津金章公司)，MH培养基干粉和19种药敏纸片(氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、氨曲南、环丙沙星、头孢替坦、头孢曲松、头孢唑啉、厄他培南、头孢吡肟、庆大霉素、亚胺培南、青霉素-G、头孢他啶、左氧氟沙星、红霉素、万古霉素、利奈唑胺、替加环素)为英国Oxoid产品。TEM基因上游引物:5＇-ATCAGCAATAAACCAGC-3 ＇， 下 游 引 物:5 ＇-CCCCGAAGAACGTTTTC-3＇;SHV 基因上游引物:5＇-AGGATTGACTGCCTTTTTG-3 ＇，下 游 引 物:5 ＇-ATTTGCTGATTTCGCTCG-3＇;ampC 基因上游引物:5 ＇-GCCAACGACAAAGGACGC-3＇，下游引物:5＇-ACCTTGCCCTGCTGCTCC-3＇。以上引物均由北京生命科学研究所合成。PCR反应体系总计40μl，Taq PCR Mix酶 20 μl，上游引物 2 μl，下游引物2 μl，DNA 模板2 μl，超纯水14 μl。

1.2 菌株来源 收集首都医科大学附属北京友谊医院细菌室2010年1月—2014年1月急诊及住院患者所分离出的大肠埃希菌和屎肠球菌混合感染24例共48株菌，经VITEK2全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)鉴定为大肠埃希菌和屎肠球菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923，为首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心保存菌株。

1.3 方法

1.3.1 药敏试验:采用2014年美国临床与实验室标准化委员会(CLSI)文件推荐的纸片扩散法对菌株进行药敏试验。具体步骤:直接取过夜培养皿上数个新鲜菌落，混匀于1．5 ml细菌稀释液管中，浊度调整到与0．5麦氏比浊管相当。用灭菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压，去掉过多的菌液。用拭子涂布整个MH琼脂平皿，反复几次，每次将平皿旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。MH琼脂平皿规格要求为直径90 mm，厚度4 mm，pH在25℃时为7．2～7．4。须待平皿上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片，每张纸片间距≥24 mm，纸片中心距平皿边缘≥15 mm，直径为90 mm的平皿所贴药敏纸片不多于6张。贴上纸片后，须在15 min内放35℃孵箱培养，培养16～18 h后读取结果。判定抗菌药物抑菌环:培养后取出平皿，测量抑菌环的直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，当质控菌的药物抑菌环直径在规定范围内，再进行试验菌的药物抑菌环直径的读取。

1.3.2 β-内酰胺酶基因检测:采用质粒提取试剂盒，操作过程按试剂盒说明书进行。方法为碱性裂解法:在电泳加样孔中，取PCR扩增产物5μl加入2%琼脂糖凝胶，在100 V电压条件下电泳1 h，用凝胶成像分析系统处理，委托北京生命科学研究所完成。

2 结果

2.1 药敏试验结果 混合菌感染中只有氨苄西林、环丙沙星和左氧氟沙星对大肠埃希菌和屎肠球菌在用药上有重叠，大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率达83．3%。见表1。

表1 大肠埃希菌和屎肠球菌混合菌感染药物敏感试验结果(%)

2.2 β-内酰胺酶基因检测结果 混合菌感染中24株大肠埃希菌对氨苄西林耐药的有20株(83.3%)，有12株检测出β-内酰胺酶基因，其中6株只检测出单一TEM耐药基因，1株只检测出单一ampC耐药基因，5株同时检出TEM和ampC耐药基因，均未检出SHV型耐药基因。见图1、2。

图1 部分大肠埃希菌PCR扩增TEM基因电泳结果M:Marker;1～4:随机选择的样本;N:阴性对照

图2 部分大肠埃希菌PCR扩增ampC基因电泳结果M:Marker;1～5:随机选择的样本;N:阴性对照

3 讨论

混合菌感染较单一菌感染患者的病情更复杂和严重，加之细菌间可能存在耐药基因的相互传递，给临床抗菌药物治疗加大了难度。

临床对于混合菌感染的常用抗菌药物治疗方式，多为根据对各单一菌感染的经验用药或细菌室给出的针对单一菌的药敏试验结果，分别选取对各单一菌敏感的两种或两种以上抗菌药物联合应用来治疗混合菌感染，这样就增加了抗菌药物的使用种类，同时也就会造成多种抗菌药物耐药性的产生。有研究报道，大肠埃希菌和屎肠球菌混合感染是最常见的混合菌感染，有革兰阴性菌参与的感染病理过程更加严重［4］。大肠埃希菌作为混合菌感染组合中所占比例最大的革兰阴性菌，其对抗菌药物的耐药情况也显得尤为重要。本研究结果显示，同时对两种混合菌起作用的常用抗菌药物有氨苄西林、环丙沙星和左氧氟沙星，大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率高达83．3%。

革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药耐药的机制包括:灭活酶的产生;PBP的改变;细胞膜通透性改变等［5-6］。大肠埃希菌对氨苄西林耐药的主要机制是β-内酰胺酶的产生，本研究检测的β-内酰胺酶基因包括 TEM型和 SHV型，质粒介导的 ampC酶ampC基因。TEM型、SHV型功能分类属于2b类酶，结构分类属于 A类酶［7］，也是产超广谱 β-内酰胺酶的主要基因型，最早由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科产生，由质粒介导从TEM-1、TEM-2和SHV-1突变而来［8］。ampC基因为质粒介导的ampC酶基因，功能分类属于1类酶，结构分类属于C类酶［9］，可见于克雷伯菌、沙门菌、费劳地枸橼酸杆菌、产气肠杆菌、奇异变形杆菌和大肠埃希菌，常携带大质粒。本研究结果显示，氨苄西林耐药的20株大肠埃希菌中TEM型耐药基因检出11株(55%)，ampC耐药基因检出6株(30%)，未检出SHV型耐药基因。检测出TEM型耐药基因的大肠埃希菌表现为对β-内酰胺类药物(包括青霉素类、第三和第四代头孢、氨曲南)耐药，但对碳青霉烯类和头霉素类药物敏感。对酶抑制剂敏感，但使用酶抑制剂复合制剂不一定有效［10］。检测出ampC耐药基因的大肠埃希菌表现为对一代至三代头孢、头霉素、氨基苷类及抗假单胞菌青霉素均耐药，但对碳青霉烯类、四代头孢和氟喹诺酮类敏感。

综上所述，TEM型β-内酰胺酶基因是混合菌感染中大肠埃希菌对氨苄西林耐药的主要耐药基因，其次是 ampC 基因。与王家平等［11］、丁娟娟等［12］和宋静静［13］研究结果较一致。混合菌感染中氨苄西林耐药的大肠埃希菌β-内酰胺酶基因的研究对于混合菌感染抗菌药物治疗具有重大意义。

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