张 伟，宋 静，王艳凯，翁俨玫，胡玉钦，刘建芳

盐酸二甲双胍是双胍类降血糖药，因其疗效确切，不良反应较小，广泛应用于2型糖尿病的治疗，是治疗糖尿病药物中最经济的品种之一，也是多个国家糖尿病治疗指南中推荐的控制高血糖的一线用药和联合用药中的基础用药［1-6］。目前国内已上市的盐酸二甲双胍单方制剂就有100多种，且包括普通片、肠溶片、肠溶胶囊、缓释片等多种剂型。其中肠溶制剂的开发是为了减轻盐酸二甲双胍的胃肠道刺激［7］，而缓释制剂的开发则是为了减少服药次数［8］。但是由于二甲双胍的体内吸收位置比较局限，主要集中在小肠上部，肠溶制剂和缓释制剂体外释放特征的改变是否影响药物的生物利用度值得考虑。国外有研究应用Gastro PlusTM软件模拟具有不同释放速率的盐酸二甲双胍制剂的体内吸收特征［9］，得出体外2 h内完全释放的盐酸二甲双胍制剂生物等效的结论，认为无需再做体内试验。研究结果提示，盐酸二甲双胍肠溶制剂和缓释制剂的生物利用度可能不如普通速释制剂。国内有研究表明，符合体外溶出度检查标准的盐酸二甲双胍普通片尽管在溶出曲线方面存在差异，但体内吸收可能一致［10］;而盐酸二甲双胍肠溶片虽然也满足药典溶出度检查标准，但体内吸收却不一定一致［11］。本研究基于上述文献报道结果，选择4种具有不同体外释放特征的盐酸二甲双胍制剂，首先测定各制剂的体外释放情况，然后以盐酸二甲双胍片(A)为参比制剂，考察了一种盐酸二甲双胍肠溶胶囊(B)和两种盐酸二甲双胍缓释制剂(C、D)在比格犬体内的生物等效性。

1 材料

1.1 药品与试剂 参比制剂A:盐酸二甲双胍速释片(中美上海施贵宝有限公司;规格:0．5 g;含量:101．2%;批号:20110904);受试制剂B:盐酸二甲双胍肠溶胶囊(北京圣永制药有限公司;规格:0．25 g;含量:99．4%;批号:20110864);受试制剂C:盐酸二甲双胍缓释片(印度 USV LIMITED公司;规格:0.25 g;含量:102．4%;批号:28009826);受试制剂D:盐酸二甲双胍缓释片(悦康药业集团有限公司;规格:0．25 g;含量:99．2%;批号:100602)。盐酸二甲双胍对照品(以C4H11N5·HCl计，纯度为100%，中国食品药品检定研究院，批号:100664-200602);乙腈为色谱纯(天津市康科德科技有限公司);十二烷基硫酸钠(SDS)为Amresco公司产品;超纯水，HealForce超纯水仪制备;其他试剂均为分析纯。空白血浆来自于健康比格犬。

1.2 仪器 UV-754紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂);RCZ-8M智能溶出实验仪(天津市天大天发科技有限公司);Agilent1100高效液相色谱系统(美国Agilent公司);BP-211D型1/10万电子天平(德国Sartorius公司);HealForce PWVF型超纯水仪(上海市Canrex分析仪器有限公司);TARGIN VX-Ⅱ涡旋仪(北京市踏锦科技有限公司);TG 16-WS台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.3 动物选择 12只健康成年比格犬(青岛博隆实验动物有限公司，合格证号:0016573)，雌雄各6只，质量12～15 kg，近2个月内未进行其他药物试验。试验方案经解放军白求恩国际和平医院医学伦理委员会批准。

2 方法

2.1 体外溶出试验 按照《普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》［12］及盐酸二甲双胍各制剂质量标准项下的相关要求，采用2010年版《中华人民共和国药典》［13］溶出度测定(附录XC)第一法装置，对待测制剂进行溶出曲线测定。其中参比制剂A以磷酸盐缓冲液(pH 6．8)1000 ml为溶出介质，分别于5、10、15、30、45 min、1、1.5、2 h 取样测定;受试制剂B先以0．1 mol/L盐酸溶液750 ml为溶出介质，经2 h取样后，在各溶出杯中加入预热至37℃的0．2 mol/L磷酸钠溶液250 ml，混匀，调节pH值至6．8，于5、10、15、30、45 min 取样测定;受试制剂 C和D以磷酸盐缓冲液(pH 6．8)1000 ml为溶出介质，分别于 5、10、15、30、45 min、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h取样测定。上述样品均采用紫外分光光度法测定二甲双胍的浓度，并计算累积溶出度。

2.2 犬血浆中二甲双胍浓度的测定

2.2.1 色谱条件:分析柱为北京迪马科技有限公司的Diamonsil C18色谱柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)，保护柱为安捷伦公司的 XDB-C18柱(20 mm×4．6 mm，5μm);流动相为乙腈－10 mmol/L磷酸二氢钠水溶液(含 4 mmol/L SDS，36∶64)，流速为1．0 ml/min;柱温为30℃;检测波长为233 nm;进样体积为20μl。

2.2.2 血浆样品预处理:取比格犬血浆样品200μl，置2 ml塑料试管中，加入20μl高氯酸溶液(30%，w/v)，涡流 2 min，离心 5 min(12 000 r/min)，吸取100μl上清液置进样瓶内，待测。

2.2.3 方法学考察:依据生物样品分析方法确证要求［13-14］，对所建犬血浆中二甲双胍测定方法进行了全面的验证。通过犬空白血浆、空白血浆含10μg/ml二甲双胍对照品的质控样品和比格犬服用盐酸二甲双胍片后的血浆样品色谱图(图1)，可见二甲双胍的保留时间约6．0 min，血浆中内源性杂质不干扰测定;该法的线性范围为 0．1 ～50．0 μg/ml，定量下限为 0．1 μg/ml;用3 个浓度质控样品(0．2、2．0、40．0μg/ml)考察日内、日间精密度，相对标准偏差(RSD)均 ＜7．2%，相对偏差(RE)为 1．5% ～4.3%;平均提取回收率为92．4%;二甲双胍血浆样品室温放置8 h、经历3次冻融循环及冷冻储存30 d，以及血浆样品处理后置自动进样器放置24 h，结果都在测定误差内，表明二甲双胍血浆样品在考察条件下稳定，满足犬血浆中二甲双胍测定要求。

图1 比格犬血浆中盐酸二甲双胍测定方法专属性色谱图A．空白血浆;B．含二甲双胍10．0μg/ml血浆样品;C．服盐酸二甲双胍片2 h后血浆样品

2.2.4 血药浓度测定:方法验证通过后测定比格犬血浆样品。为确保未知样本测定的结果准确可靠，在测定过程中进行质量控制，每个分析批随行测定均匀分布的质控样本。

2.3 生物等效性研究

2.3.1 给药方案及血样采集:采用DAS2．1．1软件提供的四制剂简化四交叉试验设计，将12只健康比格犬随机分为4组，于4个周期交叉服用A、B、C和D四种制剂，清洗期为7 d。比格犬在试验前禁食10 h过夜，第2天清晨用20 ml温水灌服参比制剂或受试制剂500 mg，4 h后统一进食。于服药前(0 h)和服药后 15、30、45 min、1、1．5、2、2．5、3、4、6、8、10、12、24 h 于后肢静脉取血约 4 ml置于肝素化试管中，3000 r/min离心 10 min，取血浆，置于－20℃冰箱中保存备测。

2.3.2 药动学参数计算和生物等效性分析:根据所测血浆中二甲双胍的浓度，采用DAS 2．1．1软件，基于非房室模型方法，计算比格犬空腹口服A、B、C和D四种制剂500 mg后不同时间血浆中二甲双胍的主要药动学参数和3种受试制剂相对于参比制剂的平均相对生物利用度。将药物浓度－时间曲线下面积(AUC0-t)、AUC0-∞和Cmax经对数转换后进行方差分析和［1－2α］置信区间分析，评价3种受试制剂与参比制剂的生物等效性;生物等效标准为受试制剂与参比制剂的 AUC0-t、AUC0-∞和 Cmax几何均值比的90%置信区间分别为80% ～125%、80% ～125%和75% ～133%［10］。tmax采用配对 Wilcoxon法检验，但不作为判断生物等效性的重要指标。

3 结果

3.1 盐酸二甲双胍制剂体外溶出度 盐酸二甲双胍普通片在45 min内溶出度达到标示量的100.1%，符合2010版《中华人民共和国药典》要求(高于标示量70%);盐酸二甲双胍肠溶胶囊在0．1 mol/L盐酸中2 h释放量平均为1．09%(低于标示量的10%)，pH 6．8磷酸盐缓冲液中45 min释放量平均为100．2%，符合2010版《中华人民共和国药典》要求(高于标示量的80%);盐酸二甲双胍缓释片24 h内平均累计溶出百分率为97．5%，具有明显的缓释特征。

3.2 血药浓度－时间曲线及药动学参数 在试验的第2周期，1只犬服用肠溶胶囊时出现呕吐现象，采血中断，故平均药动学参数计算采用11只犬的数据。两种二甲双胍缓释片相对于二甲双胍片的tmax明显延长，Cmax明显降低;二甲双胍肠溶胶囊的达峰时间与缓释制剂相似，峰浓度介于速释片和缓释片之间。见表1、图2。

表1 11只健康成年比格犬口服4种盐酸二甲双胍制剂后主要药动学参数(x±s)

图2 11只健康成年比格犬口服4种盐酸二甲双胍制剂后平均血药浓度－时间曲线A．盐酸二甲双胍片;B．盐酸二甲双胍肠溶胶囊;C．盐酸二甲双胍缓释片(进口);D．盐酸二甲双胍缓释片(国产)

3.3 生物等效性 以AUC0-24h计，受试制剂B、C、D相对于参比制剂A的平均相对生物利用度分别为(85．72 ±32．84)%、(63．65 ±17．59)%和(71．52 ±16．46)%。药动学参数90%置信区间，与参比制剂A相比，制剂 B、C 和 D 的 AUC0-24h、AUC0-∞90%置信区间均不在参比制剂的80% ～125%范围内，Cmax90%置信区间均不在参比制剂的75%～133%范围内，表明制剂B、C、D与制剂A之间均不具有生物等效性。见表2。

4 讨论

4.1 血样测定方法的选择 由于盐酸二甲双胍极性较大，在反相色谱柱上不易保留，一般采用流动相中添加离子对试剂的方法延长保留时间，常用的离子对试剂有庚烷磺酸钠［15］和十二烷基硫酸钠。本文使用了后者，通过调节离子对试剂浓度和有机相比例，确定了良好的色谱分离条件，血浆中内源性物质无干扰。文献报道二甲双胍血浆样品的处理方法多是沉淀蛋白法，曾尝试采用多种沉淀蛋白剂，以乙腈、甲醇等为蛋白沉淀剂时，由于稀释倍数多，检测限较低，最终选择30%高氯酸沉淀蛋白，分离效果和检测灵敏度均达到测定要求。

表2 3种受试制剂与参比制剂生物等效性结果

4.2 体外溶出度 体外溶出度结果表明，受试制剂B、C、D和参比制剂A均符合各制剂项下有关溶出度检查标准。但盐酸二甲双胍肠溶胶囊(受试制剂B)在0．1 mol/min酸中的溶出度虽然符合《中华人民共和国药典》规定的合格标准，即2 h内释放量不得大于标示量的10%，但是片间差异较大，其在pH 6．8的缓冲液中溶出度也符合《中华人民共和国药典》规定的合格标准，即释放量不得低于标示量的80%，片间差异较小。进口和国产缓释制剂溶出曲线相似，相似因子f2为59．2，药物在体外缓慢释放，24 h释放完全。

4.3 生物等效性 盐酸二甲双胍属于生物药剂学分类系统(BCS)Ⅲ的药物，具有高溶解性、低通透性的特点［16］;口服盐酸二甲双胍后其在胃肠道的吸收不完全，主要在小肠吸收，胃和大肠对其吸收甚微，用药后6～10 h时吸收几乎停止，平均绝对生物利用度约55%［17］。因此，二甲双胍制剂在吸收部位的浓度及停留时间会影响其体内吸收。生物等效性研究结果显示，3种受试制剂相对于参比制剂A均不等效，其中缓释制剂tmax明显延长，Cmax明显降低，但生物利用度明显不如普通片剂，是否影响治疗效果还有待临床研究。

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