陈　颍　周家德

Toll样受体9在宫颈癌细胞中的表达及抗凋亡作用

陈颍周家德

[摘要]目的研究宫颈癌Hela细胞中Toll样受体9(TLR9)的表达情况及TLR9对宫颈癌Hela细胞抗凋亡能力的影响，寻求宫颈癌免疫治疗的新途径。方法体外培养宫颈癌Hela细胞株，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hela细胞中TLR9 mRNA的表达情况；四甲基偶氮唑盐(MTT)检测不同浓度人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对Hela细胞生长抑制情况；流式细胞术(FCM)检测CpG-ODN预刺激对Hela细胞抗TRAIL诱导凋亡能力的影响。结果①TLR9 mRNA在Hela细胞中表达，应用CpG-ODN刺激24 h后，TLR9 mRNA的表达增加，与PBS对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。②MTT比色法检测显示，TRAIL蛋白可抑制Hela细胞生长，随着TRAIL蛋白浓度增加，抑制率增加。并且计算半抑制浓度IC50(223.092±3.850) ng/mL。③流式细胞术检测显示，TLR9特异性激动剂CpG-ODN刺激Hela细胞后，TRAIL诱导细胞凋亡率为(15.32±2.46)%，与无CpG-ODN预刺激组[(43.49±2.04)%]相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论TLR9特异性激动剂CpG-ODN能够增强Hela细胞抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡能力，提示TLR9在肿瘤的恶性进程中发挥作用，为宫颈癌的免疫治疗提供新的思路。

[关键词]宫颈癌；Hela细胞；Toll样受体9；细胞凋亡；CpG-ODN

作者单位： 230032合肥安徽医科大学第一附属医院妇产科

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中占第2位，仅次于乳腺癌。近年来，宫颈癌的发病率呈稳步上升趋势和年轻化趋势。虽然目前有手术、化疗和放疗等多种综合治疗手段，但宫颈癌患者5年生存率并无明显提高。因此，寻找新的预防和治疗方法成为宫颈癌的迫切问题。Toll样受体(TLRs)是近年来备受关注的一种细胞表面信号传导跨膜受体，Toll样受体9(TLR9)是TLRs家族重要成员。相对于正常宫颈上皮，TLR9在宫颈癌中的表达明显增加，但具体作用还不清楚。本研究旨在通过检测宫颈癌细胞TLR9的表达，并探索TLR9特异性结合配体CpG-ODN对Hela细胞TLR9表达及抗凋亡能力的影响，以探讨TLR9信号通路对宫颈癌细胞抗凋亡能力的影响，为宫颈癌的免疫治疗提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料来源宫颈癌Hela细胞株由中国科学院上海细胞库提供；DMEM(高糖型)培养液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均购自Hyclone公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，均购自Sigma公司；Trizol reagent购自Invitrogin公司；RT试剂盒、PCR试剂盒均购自Fermentas公司；Recombinant Human TRAIL/Apo2L购自PEPROTECH公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物公司，其他试剂均为国产分析纯；CpG-ODN(5’-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3’)由上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养Hela细胞采用常规DMEM培养液加10%的胎牛血清，于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温密闭细胞培养箱中传代培养。

1.2.2RT-PCR检测Hela细胞中TLR9的表达取生长良好，铺满瓶底约80%的细胞消化传代，以每孔105个细胞接种到6孔板，培养过夜，随机分为实验组和对照组，每组设6个复孔。实验组加入CpG-ODN(终浓度5.0 μM)，对照组加入等体积PBS溶液；24 h后加入Trizol试剂提取总RNA，20 μL体系逆转录成cDNA。TLR9引物：上游引物5’-GTGCCTTCCTACCCTGTGAG-3’，下游引物5’-AGTTGCCGTCCATGAATAGC-3’；内参照物采用β-肌动蛋白(β-actin)，上游引物5’-TCACCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物5’-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3’。退火温度TLR9为55℃，β-actin为52℃，反应循环数TLR9为40个循环，β-actin为35个循环。电泳结果：TLR9扩增产物长度为342 bp，β-actin扩增产物长度为173 bp。通过凝胶成像分析软件测得TLR9 mRNA的表达，分析目标条带与内参条带吸光度值(A)之比，进行半定量分析，以TLR9/β-actin灰度值作为其mRNA相对表达量。实验重复3次，计算均值。

1.2.3用MTT法检测细胞增殖能力每孔104个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μL。在培养箱(37℃、5%CO2)中生长24 h贴壁后，更新培养液并加入TRAIL蛋白液使终浓度为10、20、50、100、200、500 ng/mL，每个浓度设6个复孔，另设对照组(同体积的PBS)；加药后继续在培养箱中作用24 h。每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，继续孵育4 h，离心弃上清后，每孔加150 μL DMSO，选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)。6个复孔取均值，实验重复3次。细胞生长抑制率为(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.2.4流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡取生长良好，铺满瓶底约80%的细胞消化传代，以每孔106个细胞接种到6孔板，培养过夜，随机分为TRAIL+CpG-ODN组，TRAIL组，PBS对照组。其中TRAIL+CpG-ODN组提前添加CpG-ODN(5.0 μM)预刺激12 h，TRAIL组均加入TRAIL溶液，终浓度为200 ng/mL，对照组加入等体积PBS溶液；每组设6个复孔，24 h后流式细胞术检测凋亡率。弃去各组细胞培养液，PBS洗1次；用胰酶消化，加入含10%血清培养液终止消化；离心，1000 rpm×10 min，弃上清，加入1 mL预冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；离心，1000 rpm×10 min，弃上清，将细胞重悬于200 μL Binding Buffer；加入10 μL Annexin V-FITC轻轻摇匀，避光室温反应15 min；加入300 μL Binding Buffer(总反应体积500 μL)以及5 μL PI，使用流式细胞仪(Beckman Coulter,Fullerton,USA)检测；利用CellQuest Pro软件分析数据。实验重复3次，计算均值。

2结果

2.1CpG-ODN刺激后宫颈癌Hela细胞中TLR9 mRNA表达RT-PCR检测结果显示对照组及实验组均有TLR9表达，其中对照组TLR9 mRNA相对灰度值为0.672±0.095，而实验组(CpG-ODN组)TLR9 mRNA相对灰度值为0.845±0.102，明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

2.2TRAIL对Hela细胞生长的影响MTT比色法测定结果显示，不同浓度的TRAIL对宫颈癌Hela细胞生长具有不同程度的抑制作用，随着TRAIL浓度增加，对Hela细胞的杀伤抑制作用逐渐增加，呈剂量-效应关系。并且计算IC50(223.092±3.850) ng/mL,下面实验均选用接近IC50浓度(200 ng/mL)作为实验浓度。详见表2、图2。

2.3CpG-ODN对Hela细胞对抗TRAIL诱导凋亡能力的影响流式细胞仪分析结果显示未加CpG-ODN预刺激的Hela细胞，TRAIL诱导的细胞凋亡率[(43.49±2.04)%]较高；TRAIL+CpG-ODN组凋亡率[(15.32±2.46)%]与TRAIL组比较明显下降(P<0.05)。

3讨论

3.1TLR9及其作用Toll样受体属于模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)，参与微生物病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)识别，在天然免疫中发挥重要作用，调节适应性免疫反应。TLR9是该家族重要成员，定位于人染色体3p21.3上[1]。配体为细菌及病毒DNA中含非甲基化CpG基序和人工合成的寡氧核苷酸CpG基序[2]。TLR9信号通路属于MyD88依赖性信号传导通路，TLR9与CpG-ODN直接结合，同时募集MyD88，开始信号转导。最终活化AP-1、NF-κB及IRF，导致内皮黏附分子、炎症因子、干扰素及共刺激分子表达，在机体免疫、细胞凋亡、抗感染性等过程中发挥重要作用[3]。

3.2TLR9在宫颈癌Hela细胞中表达近年来，许多研究发现TLR9在多种妇科肿瘤细胞中表达，如乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、宫颈癌[6]。Lee等[7]研究发现，相对于正常宫颈上皮，TLR9在宫颈癌中的表达明显增加。提示TLR9在宫颈癌的发生发展中发挥作用，但具体作用机制还不清楚。

本次实验首先运用半定量RT-PCR方法检测宫颈癌细胞Hela细胞株是否有TLR9的表达，同时使用TLR9特异激动剂CpG-ODN作用于Hela细胞后TLR9 mRNA表达情况，结果发现两组Hela细胞均有TLR9表达，且CpG-ODN实验较对照组增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。这与Jiang等[8]的TLR9在肺癌裸鼠模型中的研究结果相似。本研究结果一方面证实Hela细胞中有TLR9表达，另一方面说明CpG-ODN作为TLR9的特异性激动剂通过上调TLR9转录进而活化TLR9通路，发挥免疫效应。

3.3TRAIL蛋白诱导Hela细胞凋亡肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo2 ligand, Apo2L)是TNF家族的新成员。Wajant等[9]用TRAIL刺激Hela细胞后均可诱发细胞凋亡。本次研究采用MTT法检测发现TRAIL可抑制Hela细胞生长，并且生长抑制率随药物浓度增加而增加,与李民华等[10]研究结果相近。

3.4TLR9信号通路增强Hela细胞抗凋亡耐受能力本次实验证实宫颈癌细胞Hela细胞中表达TLR9,进而研究TLR9是否可以增加Hela细胞系耐受TRAIL诱导细胞凋亡能力。结果发现，CpG-ODN实验组凋亡率较PBS对照组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明TLR9信号通路激活可加强Hela细胞抗凋亡耐受能力。

Ilvesaro等[11]检测人类前列腺癌PC-3细胞系及临床前列腺癌组织中均有TLR9表达，使用TLR9激动剂细菌DNA和CpG-ODN刺激TLR9表达阳性的前列腺癌细胞系，发现可以通过上调MMP-13增加癌细胞的侵袭力。而TLR9的配体不能增加无TLR9表达的前列腺癌细胞MDA-Pca2b的侵袭力。Di等[12]研究发现，以TLR9的特异性配体CpG-ODN刺激肺癌A549细胞系，可以使肿瘤细胞对TNF-α诱导的凋亡产生抵抗作用。因此，我们认为肿瘤细胞上的TLRs是有利于肿瘤细胞生存的。

本次实验证实TLR9激动剂CpG-ODN可以增强Hela细胞抗凋亡能力。TLR9的特异性配体CpG-ODN所致Hela细胞的抗凋亡能力，通过活化TLR9信号传导通路实现的，但其具体的分子机制仍待今后进一步的研究确定。相信随着对模式识别受体TLR(Toll-like receptor)的生物学特性和功能的深入研究，TLR在机体免疫调控及在肿瘤发生发展中的作用和地位越来越明显，将为寻找肿瘤免疫治疗提供新思路。

参考文献

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[3]Matijevic T,Pavelic J.Toll-like receptors: cost or benefit for cancer[J]. Curr Pharm Des,2010,16(9):1081-1090.

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[7]Lee JW,Choi JJ,Seo ES,et al.Increased toll-like receptor 9 expression in cervical neoplasia [J].Mol Carcinog,2007,46(11):941-947.

[8]Jiang DS,Wang YW,Jiang J,et al.MicroRNA-26a involved in Toll-like receptor 9-mediated lung cancer growth and migration[J].Mol Med， 2014,34(1):307-312.

[9]Wajant H,Haas E,Schwenzer R,et al.Inhibition of death receptor mediated gene induction ac ycloheximide-sensitive factor occurs at the level of or up stream of Fas associated death domain protein(FADD)[J].J Biolchem,2013,275(32):24357-24366.

[10]李民华，王惠兰，丁霏，等.顺铂对TRAIL蛋白抑制子宫颈癌细胞生长的调节作用[J].中华妇产科杂志，2008，8(8)：329-331.

[11]Ilvesaro JM,Merrell MA,Swain TM,et al.Toll like receptor-9 agonists stimulate prostate cancer invasion in vitro[J].The Prostate,2007,67:774-781.

[12]Di JM, Zhou J, Zhou XL, et al.Cyclooxygenase-2 expression is associated with vascular endothelial growth factor-C and lymph node metastases in human prostate cancer[J].Arch Med Res,2009,4(10):268-275.

(2015-01-08收稿2015-02-21修回)

读者·作者·编者

2015年《安徽医学》审稿专家座谈会在肥召开

为加强交流，集思广益，不断推进期刊的健康发展，《安徽医学》编辑部于2015年4月9日在合肥召开了部分编委及审稿专家座谈会。31位长期热情支持《安徽医学》期刊发展的编委、审稿专家参加座谈。省医学情报研究所曹迎庆副所长、情报研究室胡欣副主任及编辑部全体人员到会听取专家意见。

会议由胡欣副主任主持，编辑部张迪同志向大家汇报了2014年编辑部的工作情况，蔡刚同志为各位专家介绍了新上线的“《安徽医学》期刊在线编审系统”，并演示了在线投稿、编审等各项功能操作流程。之后，专家们在充分肯定《安徽医学》近年来取得瞩目成绩的基础上，围绕期刊今后发展目标和任务积极建言献策，并就审稿方式、如何组织和刊发高质量稿件、不断提高期刊质量等议题提出了很好的意见和建议。

曹迎庆副所长代表编辑部感谢专家们长期以来对《安徽医学》期刊的关心和支持，表示将根据专家们的意见和建议制定相应的工作计划，不断加强与专家们的沟通与交流，努力学习先进，改进不足，不断提高期刊的学术水平和编辑质量，与大家共同努力，积极推进《安徽医学》期刊的可持续发展。

《安徽医学》编辑部

Anti-apoptosis effect of cervical cancer cell with toll-like receptor 9 signaling pathway

ChenYing,ZhouJiade

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230022，China

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the expression of TLR9 in Hela cell line and the influence of TLR9 signaling pathway on apoptosis resistance of cervical cancer cell line Hela, in order to find a new approach of immunotherapy for cervical cancer. MethodsCervical cancer Hela cell line was cultured in vitro. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to evaluate the expression level of TLR9 mRNA in Hela cells. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)assay was used to detect the inhibition rate of cell proliferation of Hela cells which was plused with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) protein at different concentrations. Flow cytometry(FCM) was used to measure the rate of apoptosis cell induced by TRAIL protein. Results①The TLR9 mRNA was detected in cervical cancer Hela cell line. And the expression level of TLR9 mRNA of Hela cells incubated with TLR9 agonistic CpG-ODN was significantly higher than that in normal controls(P<0.05).②The cell proliferation of Hela cell was inhibited by TRAIL protein and the half maximal inhibitory concentration of TRAIL protein was (223.092±3.850) ng/ml.③The percentage of apoptotic Hela cells treated with CpG-ODN was (15.32±2.46)%, which decreased markedly than the control group(43.49±2.04)% without the treatment of CpG-ODN(P<0.05). ConclusionTLR9 agonistic ligand CpG-ODN induces the resistance of Hela cells to TRAIL-induced apoptosis, which suggests TLR9 signaling plays an important role in tumor progression and leads to novel immunotherapy against cervical cancer.

[Key words]Cervical cancer; Hela cells; Toll-like receptor 9; Cell apoptosis; CpG-ODN

通信作者：周家德，zhjiade@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.04.004