廖信芳 李正荣 杨清水 王万川 李柱 揭志刚

（1南方医科大学附属南海医院普外二科 广东佛山 528200；2南昌大学第一附属医院胃肠外科）

随着饮食结构的改变和人们生活水平的不断提高，结直肠癌发病率呈逐年上升趋势，仅次于肺癌和胃癌［1］。临床对结直肠癌的治疗原则是尽可能的减少创伤的同时保留最大程度的功能。目前临床多采用腹腔镜和传统开腹结直肠癌根治术进行治疗，但是研究发现许多患者可能在肿瘤根治术前或术中已经发生血行转移，从而导致治疗效果不佳［2］。鸟苷酸环化酶C（GCC）和端粒酶逆转录酶（h TERT）作为肿瘤细胞血行微转移的重要标志物，它们在正常组织不会表达，只有当组织发生癌变或恶性肿瘤中才表达为阳性［3］。本研究通过检测结直肠癌患者外周血中GCC mRNA和h TERT mRNA水平，比较两种手术治疗方式对肿瘤细胞血循环微转移的影响，以期为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年7月至2013年7月我院肛肠门诊收治的接受根治手术的结直肠癌患者为本试验研究，纳入标准：经纤维结肠镜和病理组织学证实为结直肠癌患者；无手术禁忌证者；影像学检查证实只能通过手术进行治疗者；术前未接受任何放化疗及手术治疗者；患者及家属知情同意，并签署知情同意书者。排除标准：孕产妇、哺乳期妇女；合并有心功能不全者；合并有肝、肾功能障碍者；合并有癌细胞远处转移的患者；合并有其他可能影响本研究结果的疾病，如糖尿病、高血压等基础性疾病。

符合纳入标准的患者共79例，按照随机数字表法将其分为腹腔镜组和开腹手术组，腹腔镜组39例，其中男24例，女15例；年龄43～75岁，平均（54.2±10.5）岁；癌症分型：结肠癌17例，直肠癌22例；病理分型：黏液腺癌6例，腺癌33例；根据美国癌症学会（AJCC）第7版中结直肠癌TNM分期标准［4］：I期5例，Ⅱ期17例，Ⅲ期17例。开腹手术组40例，其中男27例，女13例；年龄45～74岁，平均（55.3±9.7）岁；癌症分型：结肠癌19例，直肠癌21例；病理分型：黏液腺癌3例，腺癌37例；结直肠癌TNM分期：I期3例，Ⅱ期21例，Ⅲ期16例。两组基本资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 手术方法 腹腔镜结直肠癌根治术操作方法 患者全身麻醉后取截石位仰卧于手术台上，将消毒毛巾铺于手术切口处，通过穿刺Trocar以建立气腹来查探腹腔内的脏器有无转移等，当明确没有脏器转移和腹腔种植时严格按照腹腔镜根治术治疗原则进行左半结肠切除术、右半结肠切除术、乙状结肠切除术以及腹会阴联合直肠切除术和直肠前切除术。开腹组行全身麻醉后进行气管插管仰卧于手术台上，按照开腹手术的常规方式行根治性切除手术。两组术后均行抗感染治疗和常规治疗及护理。

1.2.2 采集标本 在手术进行之前的1d，分别抽取两组患者空腹状态下肘静脉血3m L（以第2管计算），在术后3d抽取两组患者空腹状态下肘静脉血3m L（以第2管计算），手术治疗前后的静脉血标本均采用枸橼酸钠进行抗凝处理，在添加淋巴细胞分离液分离出有核细胞后将其放置于－80℃的冰箱中保存。

1.2.3 外周血单核细胞总RNA提取 ①将已分离过有核细胞备用的血标本放置于1.5m L进口的无菌管中，离心后将上清液弃之不用；②加入1m L的Trizol试剂混匀后，置于室温下消化，10min后加入200μL的氯仿混匀并放置于室温下3min后再进行离心15min；③将上清液加入到1.5m L的试管中，同时加入0.5m L的异丙醇混匀，在室温下静置15min再离心；④将上层清液弃之不用，加入200μL的750m L／L的乙醇漂洗1次并快速离心以吸干液体；⑤待RNA沉淀适度干燥后就加入20μL的0.1%的无菌DEPC水溶解RNA，并置于－80℃低温保存以备用。

1.2.4 GCC基因和h TERT基因的引物序列GCC基因引物 序列：Homo-GC-C-F：5-TCTCCTGATGCTCAGAAAAT-3；Homo-GC-C-R：5-TCGTATTTGCACTGTCGTAG-3，片 段 的 长 度：177bp。h TERT基因的引物序列：Homo-h TERT-F：5-GAGCGACTACTCCAGCTATG-3；Homo-h TERTR：5-GCAGGAGGATCTTGTAGATG-3，片 段 长度：19bp。

1.2.5 逆转录反应 将上述得到的RNA加热到70℃使其变性并迅速将其置于冰浴以预防RNA的复性。在无菌离心管中加入18μL的RT反应液、1μL的莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶、1μL的RNasin并将其混匀，然后通过微量加样器在每个反应管中加入20μL，并同时加入5μL的RNA，最后置于37℃水浴反应30min。

1.2.6 PCR扩增 根据每个反应取43μL的PCR反应液和2μL的Taq酶于无菌的离心管中混匀，再通过微量加样器在每个反应管中加入45μL的反应液和5μL的RT反应产物，最后进行扩增：95℃下预变性5min，95℃下30s，62℃下20s，72℃下20s，总共35个循环，延伸72℃10min以后置于4℃环境下保存。

1.2.7 琼脂糖凝胶电泳法检测产物 采用1.5%的琼脂凝胶对扩增的产物进行电泳，加样量为10μL，电压设定为120V，电泳完以后将其置于溴化乙锭（EB）染色，时间为15min，然后利用清水进行漂洗，最后通过凝胶成像系统进行拍照。阳性判断标准：①GCC m RNA阳性：特异性扩增带为177bp；②h TERT mRNA阳性：特异性扩增带为191bp。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件进行数据的录入及统计学分析，计量资料的描述采用（）表示，两独立样本的比较采用独立样本的t检验，计数资料的描述采用率表示，比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者手术效果的比较 腹腔镜组手术时间长于开腹手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），术中出血量、术后排气时间、住院时间均少于开腹组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组患者手术前后外周血中GCC mRNA和h TERT m RNA的表达情况 腹腔镜组和开腹组患者手术前、手术后的GCC mRNA、h TERT mRNA阳性率表达分别进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组患者手术前后 GCC mRNA、h TERT mRNA阳性率表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），手术后的阳性率高于手术前。见表2、表3。

表1 两组患者手术效果的比较（）

表1 两组患者手术效果的比较（）

组别 手术时间（min）术中出血量（m L）术后排气时间（h）住院时间（d）腹腔镜组（n＝39）198.6±28.9136.2±40.551.2±6.8 8.5±2.2开腹组（n＝40） 172.5±29.5237.8±38.6 64.5±7.2 14.1±3.0 t值 3.872 6.931 3.056 5.892 P值0.011 0.000 0.002 0.000

表2 两组患者手术前后GCC mRNA的表达情况［n（%）］

表3 两组患者手术前后h TERT mRNA的表达情况［n（%）］

3 讨 论

结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病年龄以30～60岁为主，男性多于女性［5］。目前临床治疗结直肠癌多采用腹腔镜手术和传统开腹手术进行根治性治疗，腹腔镜手术较传统开腹手术治疗具有创伤小、手术并发症少等特点，但是研究显示腹腔镜手术根治结直肠癌尽管取得了较好的疗效，但是患者最后可能会因为肿瘤细胞的转移或复发而死亡［6］。那么腹腔镜手术根治术在肿瘤细胞的转移中是否具有促进的作用，目前许多的临床医生均已开始关注。研究显示结直肠癌细胞的转移主要通过血循环，而手术治疗失败的原因之一也是因为肿瘤细胞通过血行发生了转移，常规情况下在血液中没有癌细胞的表达，因此通过检测血循环中有无癌细胞的表达就可以判断是否存在血液微转移。微转移（micrometastasis，MM）的直径常小于2mm，可作为独立肿瘤细胞灶存在，也可以是单独的肿瘤细胞，临床上常无明显的症状，因此超声多普勒、CT以及MRI及常规的病理学检查方法等均不能检查出［7］。研究显示微转移可通过逆转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）技术进行基因水平的检测，其主要特点是利用物质的反复扩增来扩大极微量物质，以至于通过肉眼就可以观察到而达到检测的目的［8］。目前RT-PCR技术因具有高灵敏度及特异度等特点而广泛应用于肿瘤标志物的表达。鸟苷酸环化酶（GCC）作为含有374bp核苷酸序列的N－连接糖蛋白受体，主要分布在肠绒毛上皮细胞的顶端，研究发现肠外组织中不能检测到GCC，只有当细胞出现恶化、恶变和转移等，GCC才会持续的表达，因此其可作为结直肠癌细胞转移检测和诊断的重要指标［9］。人端粒酶逆转录酶（h TERT）是一种只在癌前病变和恶性肿瘤组织中才会表达的逆转录酶，也可以作为判断癌细胞有无转移的重要标志物［10］。本研究采用腹腔镜和开腹结直肠癌根治术治疗结直肠癌患者，并通过RT-PCR技术检测GCC mRNA和h TERT mRNA的表达情况，探讨两种手术方式对肿瘤细胞血行微转移的影响。

结果显示，腹腔镜组手术时间长于开腹手术组，术中出血量、术后排气时间、住院时间均少于开腹组，说明腹腔镜手术具有创伤小，疗效好等特点，这与有关研究结果一致［11］。腹腔镜组和开腹组患者手术前、手术后的GCC mRNA、h TERT m RNA阳性率表达分别进行比较，差异无统计学意义，说明两种手术方式治疗结直肠癌患者后血循环无明显的差别，这与有关研究结果一致［3］。结果提示我们腹腔镜结直肠癌根治术较传统开腹手术比较，并不会增加外周血中肿瘤细胞的转移。结果还表明两组患者手术后的GCC m RNA、h TERT mRNA阳性率表达高于手术前，说明两组患者术后确实有血循环微转移，这与有关研究结果不一致，不一致的原因可能是因为其它研究的样本量相对较少导致结果有偏差所致［12］，这也说明两种标志物可以较好的检测手术方式对微循环的影响，临床上有重要参考价值。

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