李洁莹 李佳 杨琳 陈力奋 吕慧英 陈克光 戴培东 张天宇



·基础研究·

豚鼠鼓膜超谐振动的初步观察△

李洁莹 李佳＊杨琳＊＊陈力奋＊吕慧英 陈克光 戴培东＊＊张天宇

目的 通过激光多普勒测振法观察活体与死亡后豚鼠鼓膜超谐振动的差异，以阐明鼓膜振动失真对传音的影响。方法 麻醉豚鼠后，分别给予85 dB SPL声强，0.5、1、2、4、6、8 kHz频率纯音刺激，采用紧凑式单点激光多普勒测振仪测量活体及死亡3 h后豚鼠鼓膜脐部振幅。结果 在各种刺激频率下，豚鼠鼓膜脐部均记录到不同幅值的响应。死亡3 h后，在0.5 kHz和1 kHz声刺激下，观察到超谐振动响应；但是在活体豚鼠中未观察到此现象。活体与死亡3 h后豚鼠鼓膜超谐振动的差异有统计学意义(P=0.002)。结论 豚鼠鼓膜的超谐振动是一种振动失真，活体状态下，可能存在中耳的某种生理功能抑制了这种振动失真，这样更有利于声音的清晰传递。 (中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：181-184)

激光多普勒测振；鼓膜脐；超谐振动；中耳

外界传来的声音在耳道产生的声压可通过鼓膜振动传递至听骨链。鼓膜脐部紧贴锤骨，因此脐部振动可直接反映锤骨的运动。中耳除了将外耳道中的声波能量传递至内耳以外，还起到阻抗匹配作用。在保持鼓室完整的条件下，对鼓膜脐部振动的频响特性进行定性及定量分析，可了解生理条件下中耳的传音特性。普遍认为,在听觉频率范围内，声压低于130 dB SPL，中耳是一个线性传音系统，这是由于在上述声刺激下，鼓室肌未收缩[1]。但是有文献[2]报道，在静态压力负载下，人颞骨标本的鼓膜形变表现出强烈的非线性。此外，Aerts等[3]测量死亡43 min后沙鼠听泡的鼓膜振动，给予频率为0.125～16 kHz、声压为96 dB SPL的声刺激，可观察到鼓膜振动的非线性畸变。因此，鼓膜振动响应是具有非线性特性的，只有采用高分辨率的测振设备才能观察到此种特性。紧凑式单点激光多普勒测振仪(laser Doppler vibrometer, LDV)是空间分辨率很高、非接触式的实时测量技术，可用于测量活体豚鼠鼓膜脐部振动[4]。LDV和显微镜耦合，可在显微镜视野中调节激光光斑位置，准确定位于鼓膜脐部。因此，我们使用LDV，比较活体和死亡豚鼠鼓膜脐部振幅，反映在活体和死亡状态下中耳传音特性。从生物力学观点来看，中耳的非线性来源于两方面：一方面是被动的，即鼓膜、听骨、肌腱、鼓室肌的生物材料特性；另一方面是主动的，即鼓膜张肌、镫骨肌的反射性收缩[5-6]。非线性系统的典型特征之一是超谐振动，即指激励作用于非线性系统所激发的频率除了有与其相同频率的成分外，还有与激励频率成整数倍的大幅度振动响应，即超谐振动。具有非线性特征的中耳有可能出现超谐振动的现象，但相关实验研究鲜有报道。超谐振动可以使中耳接收传入声音特征频率以外的音频成分，导致传入声音失真。但正常活体状态并不会发生明显的失真。听觉系统具有高度的频率选择性、灵敏性，这在有关耳蜗的非线性特性研究中已有很多报道[7]。那么，同样具有非线性特征的中耳是否通过某种机制参与了对鼓膜振动的初步调谐过程？本研究通过对比活体和死亡豚鼠的鼓膜频响特性，以阐明鼓膜的超谐振动对传音的可能影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 豚鼠是一种广泛应用于耳科学研究的实验动物，通常用于建立中、内耳各种病理模型[4]。本实验采用健康清洁级雄性纯色豚鼠6只(6耳)，体重为280～490 g，给予氯胺酮(50 mg/kg)和甲苯噻嗪(12.5 mg/kg)肌内注射麻醉豚鼠。实验前首先对豚鼠右耳进行耳镜检查，麻醉豚鼠后，测试右耳0.5、1、2、4、6、8 kHz的纯音听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值，以排除听觉系统疾病。对豚鼠的处理符合实验动物伦理。

1.2 测振系统 本实验在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院(卫生部)听觉医学重点实验室完成。测振系统包括紧凑式单点LDV(CLV-2534-4，Polytec公司，德国)，显微镜(OPMI 1-FC，Carl Zeiss公司，德国)，信号发生器(33220A，Agilent公司，美国)及功率放大器(RMX 850，QSC公司，美国)。激励频率强度均用声级计(AWA-5661-1B，杭州爱华仪器有限公司)将声压级校准到85 dB SPL。给声通过声激励适配器(ER-2，ER-7C，HLV-SPEC Adapter，Etymotic 公司，美国)插入骨性外耳道并监测声压。测振记录软件采用Vibsoft-20(Polytec公司，德国)。LDV测量系统示意图见图1。

图1. LDV测量系统示意图 激光束基本与鼓膜脐部垂直

1.3 测量方法 测得豚鼠ABR阈值在正常范围后，取右侧卧位，手术切除右耳耳廓及软骨外耳道，暴露骨性外耳道及鼓膜。将反光粉小心放置于鼓膜脐部(图2)，手术台转入隔音室内固定于隔振台上，使耳道适配器尖端距鼓膜脐部约2 mm。调节激光斑点大小及方向，使其聚焦于反光粉位置，且光束与鼓膜垂直，偏差<30°。关闭隔音室后，给予激励声强85 dB SPL,频率分别为 0.5、1、2、4、6、8 kHz的6个纯音频率的正弦信号，采集各个频率鼓膜脐部的振动速度响应幅值。保持豚鼠体位及与激光的相对位置，分别测量6只豚鼠右耳活体及死亡3 h后鼓膜脐部振幅。活体测量结束后立即腹腔注射致死剂量氯胺酮，在室温下保持3 h后，重复上述测量。

1.4 统计学处理 本研究使用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。由于样本量较少，采用Fisher确切概率法比较活体和死亡3 h后豚鼠鼓膜脐部出现超谐振动的比例有无差异，以P<0.05作为差异有统计学意义。

图2. A. 正常豚鼠鼓膜；B. LDV摄像记录豚鼠鼓膜脐部放置反光粉

2 结果

2.1 鼓膜脐部振动峰值响应 经耳道给予声强为85 dB SPL、频率分别为0.5、1、2、4、6、8 kHz的声刺激，在各刺激频率下，6只豚鼠鼓膜脐部均记录到峰值响应。图3显示了活体和死亡3 h后测量的鼓膜脐部峰值响应的平均幅值。活体状态下，鼓膜脐部频率响应曲线在4、6 kHz频率处响应幅值较大。死亡3 h后鼓膜脐部频率响应曲线在0.5、1、4 kHz频率处响应幅值较大。

2.2 鼓膜脐部振动的谐波分析 用Vibsoft-20软件将记录的鼓膜脐部振动响应进行傅里叶变换，分析响应的频率成分。结果显示，活体状态下，6只豚鼠的鼓膜脐部只出现激励频率的振动响应。死亡3 h后，给予1号豚鼠0.5 kHz声刺激时，鼓膜脐部除了出现0.5 kHz的振动响应外，还出现了其2倍频、3倍频和4倍频的超谐振动，即在1、1.5、2 kHz处有明显的响应幅值出现(图4)。同样，死亡3 h后，2号豚鼠在0.5 kHz声刺激下，出现2倍频的超谐振动，在1 kHz声刺激下，出现3倍频的超谐振动；3号豚鼠在0.5 kHz声刺激下，出现2倍频和4倍频的超谐振动，在1 kHz声刺激下，出现2倍频的超谐振动；4号豚鼠在0.5 kHz声刺激下，出现2倍频和4倍频的超谐振动；5号和6号豚鼠在0.5 kHz声刺激下，出现2倍频、3倍频和4倍频的超谐振动(表1)。活体和死亡3h后豚鼠鼓膜脐部在声刺激下出现超谐振动的比例差异有统计学意义(P=0.002)。

图3. 6只豚鼠活体及死亡3 h后鼓膜脐部振动速度的平均值 灰色虚线表示在豚鼠活体状态的测量结果，黑色实线表示豚鼠死亡3 h后的测量结果

图4. 1号豚鼠在0.5 kHz声刺激下鼓膜响应的谐波分析 左图和右图分别为活体和死亡3 h后1号豚鼠在0.5 kHz声刺激下的鼓膜脐部响应；f为峰值响应频率，2 f，3 f，4 f分别为2倍频、3倍频和4倍频的超谐振动频率

表1 在0.5 kHz和1 kHz声刺激下死亡

注：“+”表示观察到相应倍频的超谐振动响应，“-”表示未观察到相应倍频的超谐振动响应

3 讨论

紧凑式单点LDV的原理是通过测量从待测区域反射回的相干激光光波的多普勒频率，借助光学差拍及参考光技术，处理和分析物体表面与参考面在变形前后的位相变化、光强变化等，从而获得高精度的实时振幅测量数据，其测量的振幅精度达1 pm。由于LDV不直接接触被测目标，且反光微珠直径仅20～50 μm，因此对鼓膜脐部振动无明显影响，所以在测量鼓膜振动时几乎无机械负荷的干扰，已成为中、内耳传音测量的常规方法之一。

鼓膜因其超弹特性，在4个象限的频率响应会出现幅值及相位差异，因此通常选择刚性较大的鼓膜脐部或者锤骨尖和鼓环的中点作为一个参考点进行测量[4,8]。本实验采用记录鼓膜脐部的振幅，所观察到的死亡后豚鼠鼓膜频率响应趋势与文献[8-9]报道基本一致。人鼓膜的共振频率为0.9～1.4 kHz和3～4 kHz[5]，本实验结果中1 kHz与4 kHz纯音刺激下鼓膜脐部振动的幅值较大，可能是由于豚鼠鼓膜的共振频率在1 kHz和4 kHz附近。由于本实验动物数量较少，有待进一步增加样本量，更准确地测量豚鼠鼓膜的频响曲线。

文献报道的测量方法多在听泡壁上打孔，开放了鼓室，增加了低频声刺激下(<900 Hz)鼓膜振幅[10]，而本实验方法保持鼓室完整，从外耳道测量鼓膜脐部振幅，测得的结果更接近生理状态的振幅。

本实验首次观察到死亡后鼓膜的不同倍频响应，即超谐振动。文献报道死亡后中耳的共振频率会发生变化，约3 h后，其共振频率趋于稳定。所以本实验在动物死亡3 h后进行重复测量，与活体测量结果相比，死亡3 h后的鼓膜脐部在0.5 kHz与1 kHz声刺激下，观察到明显的超谐振动，说明鼓膜的振动出现失真。在活体条件下，鼓膜的超谐振动有可能受到抑制，这种抑制可能是由于中耳生理功能通过某种主动机制实现的，这样使传入音更清晰。

耳蜗主动机制的非线性特性已被公认，其耳声的逆向传出可在鼓膜处记录到非线性响应产物，如耳声发射[11]。但耳蜗开窗，破坏耳蜗后，所测得鼓膜脐部振幅与实验动物死亡后测得的数据进行对比无明显差异，说明死亡与耳蜗开窗后耳蜗的主动作用均消失[3]。因此，可认为本研究中豚鼠死亡后所测得的鼓膜超谐振动响应，是来自于中耳的被动机械系统，无耳蜗主动机制参与。活体时无明显超谐振动，有可能是中、内耳的主动机制对其的抑制作用。但因本研究实验动物数量较少，还需要增加样本量及对比实验，进一步验证并阐明中耳在传音过程中的主动机制对鼓膜振动失真的可能影响。

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(本文编辑 杨美琴)

Preliminary observation of the superharmonic vibration of tympanic membrane in guinea pigs

LI Jie-ying, LI Jia＊, YANG Lin＊＊, CHEN Li-fen＊, LÜ Hui-ying, CHEN Ke-guang, DAI Pei-dong＊＊, ZHANG Tian-yu

Department of Otorhinolaryngology, Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University, Shanghai 200031, China

ZHANG Tian-yu, Email: ty.zhang2006@aliyun.com

Objective To illustrate the effect of tympanic membrane vibration distortion on sound transmission by comparing tympanic membrane vibration of living and post-mortem guinea pigs using a laser Doppler vibrometer(LDV). Methods The velocity of the umbo of tympanic membrane was measured with 85 dB SPL pure tones at the frequencies of 0.5,1,2,4,6,8 kHz presented in the ear canal in living and 3 hours post-mortem guinea pigs. Results There were peak responses of the umbo with the stimulus through the whole frequency range. In 3 hours post-mortem guinea pigs, superharmonic vibrations were observed with 0.5 kHz and 1 kHz stimulus，but this phenomenon was not observed in living ones. Regarding the superharmonic vibration of tympanic membrane,there were significant differences(P=0.002) between living and 3 hours post-mortem guinea pigs.Conclusions The superharmonic vibration which only existed in post-mortem guinea pigs is a kind of distortion. In living animals, that distortion may be inhibited by middle ear through some mechanism. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:181-184)

Laser Doppler vibrometer; Umbo; Superharmonic vibration; Middle ear

上海市科学技术委员会科研计划项目(13DZ1940902；13DZ1940903)；上海市卫生局科研课题计划(XBR2011068)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科＊＊实验中心 卫生部听觉医学重点实验室 上海 200031；＊复旦大学力学系 上海 200433

张天宇(Email:ty.zhang2006@aliyun.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.03.008

2014-12-11)