山广志 ， 宗艳平， 王 晓， 卢静华

（1. 中国医学科学院医药生物技术研究所，北京100050；2. 烟台东诚药业集团股份有限公司，山东 烟台264006；3. 辽宁医学院药学院，辽宁 锦州121000）

三磷酸腺苷（ATP）作为一种辅酶，有改善机体代谢的作用，参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸以及核苷酸的代谢，能够调节神经传递、肌肉收缩以及血流量等［1］，同时又是体内能量的主要来源。三磷酸腺苷二钠（adenosine disodium triphosphate，ATP-Na2）的制剂形式主要有注射剂和片剂两种，临床上用于进行性心肌萎缩、心肌疾患、心功能不全［2］、脑出血后遗症及肝炎［3］等疾病的辅助治疗。

ATP 中的高能磷酸键不稳定，目前已知主要降解产物为一磷酸腺苷（AMP）和二磷酸腺苷（ADP）二钠盐。国家标准中ATP-Na2及有关物质的含量测定方法为重量比法［4-7］，采用紫外E 值法计算总核苷酸量，再利用HPLC 计算ATP、ADP、AMP 面积比，进而折算三者含量。总核苷酸量的测定极易受辅料和包衣材料的干扰［8］。有文献采用纸电泳法［9］和毛细管区带电泳法［10］检测ATP-Na2，前者经纸电泳法分离后，再用紫外分光光度法测定，整个实验操作过程较繁琐，结果重现性差；后者的缓冲液配制较为复杂（需精确的pH 值）。近年来有文献［11-13］采用离子对试剂的方法利用HPLC 紫外检测对ATP-Na2及有关物质进行检测。上述方法均基于样品的紫外吸收，采用特定波长对主成分及ADP、AMP 进行检测，检出成分缺乏全面性，难以全面而真实地反映制剂的组成和成分。

离子色谱法（IC）具有流动相简单，灵敏度高，环保无污染等特点，采用在线淋洗液发生器后，大大简化了流动相配制操作，并增强了方法重现性，适用于阴离子药物的分离与检测［14-18］。本文采用KOH溶液梯度洗脱建立了ATP-Na2注射液含量测定和有关物质检查的方法，经方法学验证，该方法重复性好，专属性和耐用性强，适用于ATP-Na2的质量分析和控制。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Thermo Dionex ICS-5000＋型离子色谱仪（电导检测器，Dionex AERS®500 4-mm 抑制器，淋洗液自动发生器（EGC-500），Chromeleon 7.2 色谱工作站）（ThermoFisher 公司，美国）；天平（XP205，METTLER TOLEDO 公司，瑞士）；Milli-Q 超纯水器（Integral 10，Merck Millipore 公司，德国）；水相针式过滤器（聚醚砜，批号9G020320，上海安普科学仪器有限公司，中国）。

ATP-Na2对照品:批号MKBQ5248V，HPLC纯度99.5%，水分2.6%；ADP-Na2对照品:批号SLBB1854V，HPLC 纯度99%，水分7%；AMP-Na2对照品:批号WXBB0607V，HPLC 纯度99%，水分17%（Sigma 公司）。水为超纯水（电阻率大于18.2 MΩ·cm）。

ATP-Na2注射液，批号1309152、13021342，规格为2 mL／20 mg；ATP-Na2片，批 号131101、130832，规格20 mg／片，均为市售制剂。

1.2 溶液制备

对照品溶液:精密称取ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2对照品适量，分别用超纯水制成每1.0 mL 中约含1.0 mg 的对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液:取供试品适量，加超纯水定量稀释成每1 mL 中约含1.0 mg 的溶液，摇匀，即得。

有关物质检查对照溶液:将供试品溶液稀释100 倍作为有关物质检查对照溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱:分析柱Thermo Dionex IonPacTMAS11-HC（250 mm×4 mm）；保护柱Thermo Dionex Ion-PacTMAG11-HC（50 mm×4 mm）；淋洗条件:带连续再生阴离子捕获柱（CR-TC）装置的淋洗液自动发生器（EGC-500）产生KOH，梯度淋洗程序见表1；流速:1.0 mL／min；柱温:30 ℃；进样量:10 μL；检测方式:抑制性电导检测，采用自循环模式的阴离子电解再生抑制器，抑制电流223 mA。

表1 梯度淋洗程序Table 1 Gradient elution program

2 结果与讨论

2.1 检测器的选择

方法建立过程中考察了相同样品浓度下紫外（UV）、积分安培（ED）和电导（CD）检测器的使用情况，结果发现3 种检测器在有关物质检测方面有较大差异:IC-UV 由于采用特定波长检测，与离子对HPLC-UV 条件下的结果相似，仅能检出AMP、ADP、ATP 和部分未知杂质，对产品中可能存在的其他离子无响应，且UV 并非IC 的标准检测器，故未采用UV 检测器；积分安培检测器常用于分析解离度低，电导检测器难于检测或根本无法检测的pK＞7 的离子［19］，并且ED 的样品承载量较小，试验中发现1.0 g／L 质量浓度下ATP 峰会因过载出现分叉，而降低浓度后部分微量杂质峰难以检测，导致检测范围狭窄，且对部分成分无响应。本品解离度较好，用电导检测器能够获得较好的检测效果，故未采用ED 进行检测。

2.2 响应因子的测定

电导检测器的响应信号与待测成分带电情况（电荷数）、摩尔质量、解离度等均相关［19］，为了减少对照品的使用，本方法测定了ATP-Na2与其主要降解产物AMP-Na2和ADP-Na2之间的响应因子，结果见表2。可以看出在该色谱条件下ADP-Na2相对ATP-Na2的响应因子为0.747 1，AMP-Na2相对ATP-Na2的响应因子为0.481 7，因此对已知主要降解杂质AMP 和ADP 采用加校正因子的主成分自身对照法较为合适。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验

理论塔板数按ATP 计不低于50 000，ATP 与其相邻色谱峰之间的分离度均大于2.0，供试品溶液稀释1 000 倍仍可检出ATP。

2.3.2 专属性试验

图1 ATP-Na2 的离子色谱图Fig.1 Ion chromatograms of ATP-Na2

表2 ADP-Na2、AMP-Na2 相对ATP-Na2 的响应因子Table 2 Response factors of ADP-Na2 and AMP-Na2 relative to ATP-Na2

取供试品（批号1309152）适量（约相当于ATP-Na210.0 mg），分别加入30% （质量分数）过氧化氢溶液1.0 mL、1 mol／L 盐酸溶液1.0 mL、1 mol／L 氢氧化钠溶液1.0 mL，室温放置1 h 后中和；另取样品分别置于100 ℃烘箱中加热1 h 和强光下照射24 h。上述样品分别加水稀释至10 mL，进样检测。结果表明，在该色谱条件下，本品经强酸、强碱、氧化、高温和光照破坏后，杂质峰面积增加，同时主峰后存在未知杂质峰；所有杂质峰均能与主峰完全分离，表明本方法专属性良好。

2.3.3 线性关系

精密称取ATP-Na2对照品45.7 mg，逐级稀释至质量浓度分别为1.83、0.914、0.366、0.183、0.073 1、0.014 6、0.003 66、0.000 146 g／L 的系列对照品溶液；精密称取ADP-Na2对照品37.8 mg，逐级稀释至质量浓度 分 别 为1.51、0.756、0.302、0.060 5、0.012 1、0.002 42、0.000 484 g／L 的系列对照品溶液；精密称取AMP-Na2对照品40.2 mg，逐级稀释至质量浓度分 别 为0.804、0.402、0.161、0.032 2、0.006 43、0.001 29、0.000 426 g／L 的系列对照 品 溶液。在1.3 节色谱条件下进样，记录色谱图。以样品质量浓度（C，g／L）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，分别拟合回归方程并计算相关系数，结果见表3，本色谱条件下ATP-Na2、ADP-Na2和AMP-Na2的线性良好。

2.3.4 定量限及检出限

定义S／N ＝3 时的质量浓度为检出限（LOD），S／N ＝10 时的质量浓度为定量限（LOQ），ATPNa2、ADP-Na2、AMP-Na2的检出限和定量限结果见表3。

表3 待测离子的线性关系及LOQ 和LODTable 3 Linear relationships，LOQs and LODs of the ions

2.3.5 精密度、重复性和稳定性试验

取1.0 g／L 的ATP-Na2对照品溶液，连续进样6 次，其峰面积的RSD 为0.57%，表明本方法精密度良好。

取批号为1309152 的样品，平行制备6 份1.0 g／L 的 溶 液，进 样检 测，ATP-Na2平均 含 量 为105.6%，RSD 为0.32%，表明本方法重复性良好。

取ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2对照品溶液，在室温下放置0、3、6、9、12、24 h 后分别进样，结果峰面积的RSD 分别为1.3%、1.4%、2.5% （n ＝6），表明对照品溶液在室温条件下24 h 内稳定。

2.3.6 回收率试验

精密量取1.0 mL（10 g／L）的供试品（批号1309152）9 份，分别置于25 mL 的容量瓶中，加入精密称取的ATP-Na2对照品约10.0、15.0、20.0 mg各3 份，用超纯水稀释至刻度，制成质量浓度约为0.8、1.0、1.2 g／L 的溶液，分别进样，结果见表4。

2.3.7 方法耐用性

取供试品（批号1309152）在不同流速（±10%）、柱温（±5 ℃）等色谱条件下测定，各条件下主峰的理论塔板数均大于50 000，主峰与相邻杂质峰分离度大于3.8，主成分平均含量为105.4%，RSD 为0.51%（n ＝6），表明本方法耐用性良好。

表4 注射液中ATP-Na2 的加标回收率和相对标准偏差Table 4 Recoveries and RSDs of ATP-Na2 in injection

2.3.8 样品测定

取4 批市售样品，按1.2 节下方法制备供试品溶液和有关物质检查对照溶液。按1.3 节条件进样测定，按外标法计算主成分含量，按加校正因子的主成分自身对照法计算ADP-Na2和AMP-Na2含量，结果见表5。

表5 注射液及片剂中ATP-Na2 及其有关物质含量的测定结果Table 5 Contents of ATP-Na2 and related substances in injections and tablets

3 结论

本文建立了测定ATP-Na2注射液中主成分及有关物质含量的离子色谱法，采用外标法进行含量测定，利用加校正因子的主成分自身对照法进行已知降解产物ADP-Na2和AMP-Na2的定量，方法简便易行，绿色无污染。方法学验证结果显示该方法重现性好，灵敏度能够满足ATP 制剂中杂质的检测要求，结果准确。

本方法显示了较强的分离能力，除了能够对主成分及其杂质进行检测以外，还能够完成对部分辅料的检测，能全面和有效地反映和控制三磷酸腺苷产品的质量，可为生产企业开展质量控制提供依据和借鉴。

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