郭守东， 桑 慧， 杨娜娜， 阚玉杰， 李富裕， 李 煜， 李方圆， 秦树存

（山东省高校动脉粥样硬化重点实验室，泰山医学院，山东 泰安271000）

脂蛋白自身结构的改变是影响其生物学功能的主要原因之一，脂蛋白因自身结构改变而失去原有功能的现象在多种疾病中普遍存在［1，2］。脂蛋白的糖基化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，对于维持脂蛋白的功能至关重要。唾液酸是蛋白质糖基化过程中最后添加到糖链末端的9 碳糖，通过糖苷键连接于糖链的非还原末端。唾液酸化修饰主要是指N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid，NANA）化修饰，广泛存在于生物体内［3］。脂蛋白上的唾液酸大多数聚集在载脂蛋白部分，位于寡糖链的非还原末端，每个脂蛋白颗粒上平均含有12 ～14 个唾液酸。这些唾液酸所提供的负电荷对于防止脂蛋白之间及其与内皮细胞表面的非正常吸附具有重要的意义。研究表明，去唾液酸化与动脉粥样硬化等心血管病变的发生和发展密切相关［4-7］。因此唾液酸的精确测定是研究脂蛋白糖基化修饰与脂蛋白功能的重要技术手段之一。

测定唾液酸的方法主要包括高效液相色谱法［8，9］、气相色谱法［10］、毛细管区带电泳法［11］和化学比色法等。化学比色法操作简单，但灵敏度欠佳，不适用于微量生物样本的测定。唾液酸的紫外吸收十分微弱，在采用高效液相色谱法和气相色谱法进行检测时，需要衍生处理，费时费力。本文建立了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS／MS）快速测定血浆及脂蛋白唾液酸的方法，并对糖尿病患者与健康人血浆及脂蛋白唾液酸含量进行了对比分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters Symmetry C18 分析柱（100 mm ×2.1 mm，3.5 μm）（美国Waters 公司）；3K30 型高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）；Optima L-80XP 型超速离心机（美国Beckman 公司）；LC-MS／MS 由HPLC 系统（LC-20AD、DGU-20A3 脱气机和SIL-20AC 自动进样器，日本岛津公司）、串联质谱仪（4000 QTRAP，美国AB SCIEX 公司）和氮气发生器（ABN2ZA，英国PEAK 公司）组成。

NANA（纯度为99%）及甲醇、甲酸、醋酸、甲酸铵、槲皮素（纯度≥95%）购于Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；蛋白测定试剂盒购于美国Invitrogen公司；去离子水由Millipore 纯水机制备；其他化学试剂为国产分析纯。

人血浆样本由泰山医学院附属医院提供。

1.2 样本制备

19 例健康人（41 ～59 岁，平均年龄50.7 岁）和17 例Ⅱ型糖尿病患者（42 ～60 岁，平均年龄51.6岁）的血浆样本采集于空腹12 h 之后的早餐前。抗凝血液经1 000 g 离心力离心15 min 后获得血浆。将新鲜血浆移入离心管，调密度d 至1.006 g／mL，充N2，封口。于10 ℃下以40 000 r／min 的转速离心24 h，取上层液体，获得极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）；下层液体调节密度d 至1.063 g／mL，于10 ℃下以40 000 r／min 的转速离心48 h，获得低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）；剩余液体调密度d 至1.21 g／mL，于10℃下以40 000 r／min 的转速离心48 h，得到高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）。脂蛋白经透析，充N2，封口备用。

取20 μg 蛋白样本，加入pH ＝2 的醋酸溶液200 μL，80 ℃下水解，不同时间点取样，考察水解时间对唾液酸降解的影响，确定最佳水解时间。

1.3 LC-MS／MS 分析

本研究采用的色谱柱为Waters C18 分析柱（Waters Symmetry，100 mm × 2.1 mm，3.5 μm），同 时 配 备Waters 保 护 柱（10 mm × 2.1 mm，3.5 μm）。流动相为含有4 mmol／L 甲酸铵和0.1% （v／v）甲酸的5% （v／v）甲醇溶液，线性洗脱。进样体积为5.0 μL，流动相流速为0.3 mL／min。质谱采用电喷雾离子源（ESI）的多反应监测（MRM）模式，温度500 ℃，雾化气、辅助气和气帘气的压力分别设定为380、380 和140 kPa，其中碰撞气设在中等档，在正、负离子模式下的喷雾电压（ion-spray voltage）分别为4 500 V和-4 500 V。NANA 的质谱分析参数见表1。数据使用AB SCIEX 软件V1.6 进行分析。

表1 NANA 的质谱分析参数Table 1 MS／MS parameters of NANA

1.4 标准溶液的配制

用去离子水配制500 μg／mL的NANA 储备液，分装后于-20 ℃保存。通过标准样品添加回收率试验进行方法学验证。

1.5 双氧水对脂蛋白去唾液酸化的影响

实验组采用终浓度为10 μmol／L的H2O2分别处理质量浓度均为10 μg／mL的HDL 和LDL；对照组另外添加终浓度为10 μmol／L的槲皮素对脂蛋白进行保护。37 ℃下孵育6 h 后终止，采用LC-MS／MS 检测两组脂蛋白上的唾液酸含量。

1.6 统计学分析

采用SPSS17.0 进行统计学分析。数据以“平均值±标准差”的形式表示。组间比较采用t 检验，P≤0.05 则具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件

NANA 是哺乳动物体内唾液酸的主要存在形式。本研究分别在正、负离子模式下对NANA 的质谱分析条件进行了优化。最终确定NANA 在正、负离子模式下的监测离子对分别为m／z 310.0／274.0和m／z 308.1／86.7。在正、负离子模式下，NANA的典型质谱碎片如图1 所示。经比对分析，NANA在负离子模式下检测结果所得S／N 比值最佳，因此本文均采用该条件进行脂蛋白唾液酸含量分析。

图1 NANA 在（a）正、（b）负离子模式下的二级质谱图Fig.1 MS／MS spectra of NANA in （a）ESI ＋and （b）ESI-mode

2.2 醋酸水解血浆及脂蛋白唾液酸时间的考察

实验中，采用易挥发的醋酸对血浆和HDL 中的NANA 进行温和水解。以脂蛋白为例，相同色谱条件下所得峰面积对水解时间作图，如图2 所示，水解时间在2 h 后，唾液酸并无显著增加。确定最佳的水解条件为pH ＝2 的醋酸在80 ℃下水解2 h。

2.3 方法学验证

在负离子模式下，NANA 的检出限（S／N ＝3）和定量限（S／N ＝10）分别为7.4 和24.5 pg。采用NANA 标准溶液添加法制作的标准曲线为y ＝347.34x ＋5 037.6（R2＝0.998 1）；其中y 为峰面积，x 为相应进样的质量浓度（ng／mL）。在2.5 ～80 ng／mL 范围内呈良好的线性关系。加标回收率为98.59% ±3.4%（n ＝6）；日内和日间精密度分别为2.16%（n ＝6）和4.34%（n ＝6）。

2.4 脂蛋白唾液酸含量的测定

水解后的血浆或脂蛋白样品加入4 倍体积的甲醇，经20 000 g 的离心力离心20 min，取上清液。上清液经0.22 μm 过滤器过滤后直接进行LC-MS／MS 分析。17 例糖尿病患者和19 例健康人血浆中平均唾液酸含量分别为（548.3 ±88.9）mg／L 和（415.3 ±55.5）mg／L；糖尿病患者的VLDL、LDL 和HDL 唾液酸的含量依次为（4.91 ±0.19）、（6.95 ±0.28）和（3.61 ±0.22）μg／mg ；健康人VLDL、LDL和HDL 唾液酸的含量依次为（2.90 ±0.27）、（7.03±0.04）和（2.40 ±0.09）μg／mg。糖尿病患者血浆中唾液酸含量、VLDL 唾液酸含量和HDL 唾液酸含量均显著高于健康人（P ＜0.01）；而糖尿病患者LDL 唾液酸含量与健康人相比无显著差异。

2.5 脂蛋白去唾液酸化的测定

氧化应激可导致糖尿病患者体内LDL 的去唾液酸化［12］。为探讨糖尿病患者体内脂蛋白在氧化应激状态下发生去唾液酸化的难易，本文采用H2O2处理脂蛋白，同时设立天然抗氧化剂槲皮素保护组。实验结果表明，采用H2O2处理LDL 后，其唾液酸含量与对照组相比下降了18.2% （P ＜0.01）；加入槲皮素可显著降低H2O2引起的LDL去唾液酸化（P ＜0.05）（见图3）。而采用相同浓度的H2O2处理HDL，虽然HDL 发生了部分去唾液酸化，但与对照组相比，差异不显著（见图3）。这可能是因为HDL 中存在对氧磷酶、载脂蛋白apoA-Ⅰ等具有抗氧化功能的蛋白［13］，从而有效降低了H2O2对HDL 造成的氧化损伤。

图3 H2O2 引起的糖尿病患者脂蛋白去唾液酸化及槲皮素的保护作用Fig.3 Desialylation of lipoprotein from diabetics induced by H2O2 and the protective effect of Quercetin.

研究结果显示:H2O2可致脂蛋白去唾液酸化，而加入天然抗氧化剂槲皮素保护后，脂蛋白去唾液酸化程度降低；更为重要的是，在同等氧化应激状态下，LDL 较HDL 更容易发生去唾液酸化。糖尿病患者的LDL 比健康人的LDL 含有更多的脂肪酸，因而更易于被氧化［14］。此外，NANA 在氧自由基的作用下，自身脱去1 位的羧基，产生1 分子CO2［15，16］，这可能是糖尿病患者的LDL 中NANA 并未显著增高的原因之一。脂蛋白上大约50% 的负电荷是由唾液酸提供的，而糖尿病患者脂蛋白唾液酸含量较健康人发生了显著改变，处于寡糖链末端的唾液酸改变会影响脂蛋白的正常生理功能［17，18］。

3 结论

除比色法、高效液相色谱法、气相色谱法和毛细管区带电泳法之外，国内也有报道采用LC-MS／MS测定食品中唾液酸的方法［19，20］。本文报道的方法较之以前方法有以下优势:采用挥发性的醋酸在密封条件下对样本进行处理，而非采用硫酸、磷酸或盐酸等挥发性较小的酸，可有效保护质谱仪；样品经水解、离心和过滤后直接进行LC-MS／MS 分析，无需对样品做进一步预处理。该法既可避免前处理过程中唾液酸的丢失，提高回收率，又节省时间和费用，可广泛应用于血浆脂蛋白唾液酸含量分析。此外，糖尿病患者血浆的VLDL 和HDL 中唾液酸含量显著高于健康人，而LDL 唾液酸含量并未发生显著改变，这可能是由于糖尿病患者LDL 含有过多的脂肪酸而易于被氧化有关［14］，其具体分子机制尚需进一步阐明。

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