1-乙基-3-甲基咪唑L-乳酸盐作为手性配体用于氨基酸的手性拆分

2014-12-26余丽双陈毅挺

色谱 2014年11期

黄露，余丽双，陈毅挺

（1. 闽江学院化学与化学工程系，福建福州350108；2. 福建中医药大学药学院，福建福州350122）

手性配体交换毛细管电泳（CLE-CE）是一种常见的毛细管电泳手性分离模式，主要用于氨基酸、羟基酸及二肽等对映体的手性拆分。CLE-CE 利用手性配体与中心离子形成的配合物与对映体发生交换作用来实现对映体的手性拆分。因此，手性配体的选择在CLE-CE 体系中是至关重要的。目前，CLECE 的手性配体主要是一些氨基酸［1，2］、氨基醇［3］及α-羟基酸等［4］。离子液体是在室温或接近室温下呈现液态、完全由阴阳离子组成的盐，一般由有机阳离子和无机阴离子组合而成。离子液体具有很多独特性能，诸如无味、不燃、蒸汽压低、可操作温度范围宽、热稳定性和化学稳定性良好、离子迁移和扩散速度快等。如果将手性基团引入到离子液体结构中，那么就能获得具有手性特征的离子液体。手性离子液体结合了离子液体和手性物质两方面的优点和特性，其作为手性溶剂或手性诱导剂，已被成功用于不对称合成［5，6］、气相色谱［7］、液相色谱［8，9］和毛细管电泳［10-13］等领域。目前，已有少数手性离子液体被当作手性配体用于毛细管电泳手性分离，如1-烷基-3-甲基咪唑-L-脯氨酸［10］、L-鸟氨酸为阴离子部分的手性离子液体［14］、L-脯氨酸为阳离子部分的手性离子液体［15］以及L-赖氨酸为阴离子的手性离子液体［16］。本文以 1-乙基-3-甲基咪唑 L-乳酸盐（［EMIM］［L-Lac］）为手性配体，以色氨酸对映体（Trys）、苯丙氨酸对映体（Phes）、酪氨酸对映体（Tyrs）为拆分对象，对影响手性拆分的诸多因素进行考察，建立［EMIM］［L-Lac］拆分手性对映体的新方法。同时将L-乳酸（L-Lac）作为手性配体用于Trys 的手性拆分，对L-Lac 和［EMIM］［L-Lac］的手性拆分能力进行对比。最后在上述实验的基础上，对手性拆分机理进行了探讨。

1 实验部分

1.1 试剂

D-色氨酸、L-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-酪氨酸和L-酪氨酸（纯度为99%，Aladdin）；［EMIM］［L-Lac］和EMIM-Ace（纯度为99%，上海成捷化学有限公司）；L-乳酸（纯度为99%，上海国药集团化学试剂有限公司）；氯化铜和其他药品及试剂均为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 电泳操作

电泳分离均在俄罗斯刘梅克斯公司的CAPEL 105 型毛细管电泳仪上完成。采用的未涂层石英毛细管购于河北永年县锐沣色谱器件有限公司，规格为50 μm i. d. ×61 cm（有效长度52 cm）。进样前，毛细管分别用0.1 mol／L NaOH、水和电泳缓冲溶液冲洗5 min，再在25 kV 电压下平衡10 min。样品采用压力进样（3.5 kPa，30 s），分离电压为25 kV，分离温度为20 ℃，检测波长为200 nm。

3 对对映体样品分开配制。D-Try 和L-Try，以及D-Phe 和L-Phe 直接用水溶解至1 g／L。D-Tyr和L-Tyr 先用0.1 mol／L NaOH 溶解后再加水至1 g／L。使用前按照需要用水稀释。运行缓冲液的配制:将手性配体和金属盐直接溶于水中，再用1 mol／L HCl 或1 mol／L NaOH 调节至所需pH 值。所有溶液注入毛细管前均需用0.45 μm 孔径滤膜过滤。

1.3 计算

对映体的电渗流速率（μeof）计算参照公式（1）:

其中Lt是毛细管的总长，Ld是毛细管的有效长度，V 是分离电压，teof是丙酮的迁移时间［17］。

对映体的有效电泳迁移速率（μep）计算参照公式（2）［18］:

其中tm是对映体的迁移时间。

2 结果与讨论

2.1 背景电解质的选择

实验发现，［EMIM］［L-Lac］不溶于磷酸盐或硼砂等常规缓冲介质，配制过程中会产生白色絮状物沉淀。因此，直接将［EMIM］［L-Lac］和氯化铜用作背景电解质，水为溶剂。

2.2 中心离子的选择

针对中心离子，主要对4 种常见的二价金属离子（Cu2＋、Ni2＋、Zn2＋及Co2＋）进行了考察。实验发现，使用Ni2＋、Zn2＋和Co2＋作为中心离子，Trys、Phes 和Tyrs 毫无拆分趋势，而Cu2＋表现出较好的手性拆分能力。此外，铜盐的阴离子对手性拆分也有很大的影响。相同条件下，使用硫酸铜和醋酸铜提供中心离子时，对映体只有极微的拆分趋势；而使用氯化铜时，对映体则能接近基线分离。因此，最后选择氯化铜作为中心离子提供试剂。

2.3 ［EMIM］［L-Lac］与Cu2 ＋的物质的量比与浓度的影响

手性配体与中心离子的物质的量比和浓度对对映体的手性拆分均有很大影响。图1 显示了［EMIM］［L-Lac］与Cu2＋的物质的量比对Trys、Phes 和Tyrs 分离度（Rs）和迁移时间的影响。可以看出，随着物质的量比的增大，手性分离度会随之增大，然而当物质的量比超过一定程度后，手性分离度便会随之减小；迁移时间则随之增大。实验最终确定［EMIM］［L-Lac］与Cu2＋的物质的量比为2∶1。

固定手性配体与中心离子的物质的量比，进一步考察了不同浓度的手性配体与中心离子对3 对对映体手性拆分的影响（如图2 所示）。当［EMIM］［L-Lac］与Cu2＋的浓度过小时，3 对对映体不能得到手性拆分；浓度过大时，对映体的检测灵敏度会随之降低，手性分离度也随之减小。实验最终确定［EMIM］［L-Lac］与Cu2＋的浓度分别为40 mmol／L和20 mmol／L。值得注意的是，使用氯化铜作中心离子提供试剂时，由于氯离子具有微弱的配位能力，因此会产生背景系统峰。

2.4 pH 的影响

缓冲溶液pH 值范围的选择主要取决于所选用的中心离子。通常情况下，Cu2＋在弱酸性条件下具有较好的手性拆分能力。因此，我们考察的pH 范围为3.5 ～5.5。实验发现，随着pH 值的升高，手性分离度先增大后减小。此外，迁移时间随着pH 的增大而缩短。综合考虑手性分离度和迁移时间，最终选定4.5 作为运行缓冲液的pH 值。

综上所述，Trys、Phes 和Tyrs 的最佳手性拆分条件为20.0 mmol／L 氯化铜及40.0 mmol／L［EMIM］［L-Lac］混合液（pH 4.5），此时，Trys、Phes和Tyrs 的手性拆分情况如图2 所示。

图1 ［EMIM］［L-Lac］与Cu2 ＋的物质的量比对Rs 和迁移时间的影响Fig.1 Effects of the ratio of［EMIM］［L-Lac］to Cu2 ＋on Rs and migration time

2.5 对比实验

图2 Tyrs、Phes 和Trys 的手性拆分图Fig.2 Enantioseparation of Trys，Phes and Tyrs

为了验证［EMIM］［L-Lac］的良好性能，实验将L-乳酸作为手性配体用于Trys 的手性拆分。结果发现，单独使用L-乳酸时，Trys 只能得到部分拆分；加入EMIM-Ace 后，Trys 手性分离情况得到了很大改善。实验进一步对L-乳酸体系及EMIM-Ace 辅助L-乳酸体系的分离条件进行优化，最佳拆分效果如图3a 和3b 所示。可以看出，使用EMIM-Ace 辅助L-乳酸进行手性拆分时，Trys 出峰时间非常长，且峰形展宽现象较为严重。而最佳实验条件下，使用［EMIM］［L-Lac］进行手性拆分时（如图3c 所示），Trys 在15 min 内均已出峰。另外，实验还对80 mmol／L ［EMIM］［L-Lac］和40 mmol／L Cu2＋（pH 3.5）拆分Trys 的情况进行了考察，结果发现，此条件下Trys 的分离情况很差，出峰时间为19 ～20 min。与相同条件下的 L-乳酸体系相比，［EMIM］［L-Lac］体系的出峰时间仍然较短。

图3 Trys 手性拆分对比图Fig.3 Comparison charts on enantioseparation of Trys

2.6 分离机理

CLE-CE 主要是依靠对映体与手性配体和中心离子形成的配合物的稳定性差别进行手性拆分的。不同的稳定性导致了不同的迁移时间，因而对映体才能被分离。而对映体的迁移时间主要取决于μep和μeof。因此，可以通过分析μep和μeof来推断分离机理。

如图4a 所示，随着［EMIM］［L-Lac］浓度的增大，每对对映体μep的差别先增大后减小，这与Rs的变化相一致。Trys、Phes 和Tyrs 的等电点分别为5.89、5.48 和5.66。因此在pH 4.5 的情况下，各对映体以阳离子形式存在，μep应为正值。这与实验结果相一致。另外，从图4b 可以看出，当［EMIM］［LLac］的浓度从20 增加到80 mmol／L 时，μeof从1.79×10-4降至0.961 ×10-4cm2V-1s-1。

手性拆分机理如图5 所示。通常情况下，毛细管内壁由于硅羟基的质子化而带负电荷，这样会使得阳离子在内壁上发生聚集，当施加一定正向电压时，阳离子会带动溶液整体往负极运动。本实验中，当［EMIM］［L-Lac］进入毛细管后，［EMIM］［LLac］在水溶液中会形成解离平衡。部分解离的咪唑阳离子会吸附在毛细管内壁上，使毛细管内壁带上正电荷，这些正电荷会引起负电荷聚集，从而使得原本正电荷聚集所产生的电渗流被抑制。随着［EMIM］［L-Lac］浓度的增加，越来越多解离的咪唑阳离子会吸附在管壁上，从而导致电渗流进一步降低、迁移时间进一步延长。另外，溶液中未解离的［EMIM］［L-Lac］经过两步反应生成三元配合物。而解离的L-乳酸根阴离子会与H＋结合生成L-Lac，L-Lac 也会经由两步反应生成三元配合物。

图4 ［EMIM］［L-Lac］的浓度对（a）μep和（b）μeof的影响Fig.4 Effects of［EMIM］［L-Lac］concentration on （a）μep and （b）μeof

图5 ［EMIM］［L-Lac］作手性配体的手性拆分机理Fig.5 Mechanism of enantioseparation using［EMIM］［L-Lac］as the chiral ligand

参照2.5 节对比实验部分，结果发现使用EMIM-Ace 辅助L-Lac 进行手性拆分时，只需加入5 mmol／L EMIM-Ace，就能明显降低电渗流并延长迁移时间（如图3b 所示）。因此可以推断，在EMIMAce 辅助L-Lac 体系中，EMIM-Ace 仅被用于抑制电渗流，并未参与手性配体交换反应。而在［EMIM］［L-Lac］体系中，参与手性配体交换反应的主要是未解离的［EMIM］［L-Lac］，而不是解离后的L-乳酸根离子形成的L-乳酸。因为如果参与手性配体交换反应的主要是L-Lac，那么将会形成大量解离的咪唑阳离子，而大量的咪唑阳离子势必会大大降低电渗流并延长迁移时间。然而实验结果却相反，使用80 mmol／L［EMIM］［L-Lac］时，Trys 的迁移时间反而更短。这一现象证实了参与手性配体交换反应的主要是未解离的［EMIM］［L-Lac］，且［EMIM］［LLac］在运行缓冲液中只发生部分解离。这是因为三元配合物的形成使得溶液中未解离的［EMIM］［LLac］减少，从而使反应朝着结合的方向进行，抑制了［EMIM］［L-Lac］的解离。综上所述，CLE-CE 中手性离子液体对手性拆分的影响并不仅仅是阴离子和阳离子影响的简单叠加。相对于简单的手性配体，手性离子液体由于其分子体积较大，生成的三元配合物的稳定性差异也较大，因而表现出更好的手性拆分能力。

3 结论

本文利用手性配体交换毛细管电泳法，成功地将1-乙基-3-甲基咪唑L-乳酸盐作为手性配体用于色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸对映体的手性拆分。与L-乳酸作手性配体相比，［EMIM］［L-Lac］表现出良好的手性拆分能力。研究证实了基于α-羟基酸为阴离子的手性离子液体在手性拆分上的可行性，并预示了其在毛细管电泳中的应用前景。

［1］ Qi L，Yang G L，Zhang H Z，et al. Talanta，2010，81（4／5）:1554

［2］ Zhang H Z，Qi L，Qiao J，et al. Anal Chim Acta，2011，691（1／2）:103

［3］ Rizkov D，Mizrahi S，Cohen S，et al. Electrophoresis，2010，31（23／24）:3921

［4］ Kuo C Y，Liao K S，Liu Y C，et al. Molecules，2011，16（2）:1682

［5］ Siyutkin D E，Kucherenko A S，Struchkova M I，et al. Tetrahedron Lett，2008，49（7）:1212

［6］ Zhang L，Luo S Z，Mi X L，et al. Org Biomol Chem，2008，6（3）:567

［7］ Ding J，Welton T，Armstrong D W. Anal Chem，2004，76（22）:6819

［8］ Bi W T，Tian M L，Row K H. Analyst，2011，136:379

［9］ Tang F，Zhang Q L，Ren D D，et al. J Chromatogr A，2010，1217:4669

［10］ Liu Q，Wu K K，Tang F，et al. Chem-A Eur J，2009，15（38）:9889

［11］ Zhang J J，Du Y X，Zhang Q，et al. J Chromatogr A，2013，1316:119

［12］ Zhang Q，Du Y X. J Chromatogr A，2013，1306:97