孙 晶， 曹 玲， 冯有龙， 谭 力

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京210008）

中成药及保健食品中化学药物的非法添加现象呈逐年上升趋势，其中补肾壮阳类中成药和保健食品一直以来都是非法添加的重灾区，添加物是以西地那非和他达拉非为代表的5 型磷酸二酯酶（phosphodiesterase-5，PDE-5）抑制剂［1］。该类药物的突出特点就是衍生物数量庞大、结构相似［2］（如表1所示）、活性相近且合成简单，但衍生物的对照品却相对难得。尽管最新的国家药品检验补充检验方法（批准件编号为2009030）中检测的PDE-5 抑制剂数目已达11 种，但国内外文献中却不断有该类化合物新衍生物的非法添加报道，数目已不下40 种［3，4］；并且标准检验方法中11 种对照品价格十分昂贵，其他PDE-5 抑制剂衍生物的对照品更不易获得，监控形势十分严峻。

表1 PDE-5 抑制剂的分类、结构式和典型共有碎片离子Table 1 Types，formulae and typical common product ions of PDE-5 inhibitors

表1 （续）Table 1 （Continued）

表1 （续）Table 1 （Continued）

液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS／MS）具有高通量、灵敏、专属等特点，是目前从成分、基质复杂的中药保健食品中筛选和仲裁非法添加物的最有效方法［3］。按照质量分析器划分，质谱可分为三重四极杆质谱、离子阱质谱和高分辨质谱（如飞行时间质谱）。对于检测新的PDE-5 抑制剂衍生物，目前文献中常用的LC-MS／MS 扫描模式存在一定的局限性:三重四极杆质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式［5］灵敏度高，适合定量［6］，但由于限定母／子离子对，对设定的目标化合物以外的物质均“不可见”，未知衍生物因此被忽略；三重四极杆或离子阱质谱全扫描模式［7］信息量大，但是非法添加物和样品基质中的天然组分不易区分，筛选未知的非法添加物对操作者的质谱解析能力要求高，且需要时间和精力，故往往事倍功半；数据库软件筛查源于全扫描模式代替人工查阅数据，节省时间，但判定参数的设置对结果影响较大，且该法需要建立标准图库［8，9］，对超出检测名单的新型衍生物的发现和鉴定能力有限［3］；高分辨质谱具有高分辨率，专属性大大提高，已有许多成功应用案例［8，9］，但是仪器价格昂贵，制约其推广。

三重四极杆扫描模式除常用的多反应监测模式外，还有中性丢失扫描（neutral loss scanning）和前体离子扫描（precursor ion scanning，或称为母离子扫描（parent ion scanning））模式，两者都是筛选未知化合物的有力手段，其中前体离子扫描尤其适合筛选结构相似的化合物，如同系物；而非法添加的新趋势是添加已知疗效药物的衍生物，正具有结构相似这一特点。本文把易被忽视的三重四极杆前体离子扫描（或母离子扫描）功能［10］应用于PDE-5 抑制剂的快速筛查中，是非法添加检测的一种新的尝试，国内鲜有报道。本研究通过三重四极杆质谱的多种扫描功能（全扫描、子离子扫描）分析PDE-5 抑制剂的质谱特点，寻找共有结构碎片，将其分为5 类:红地那非类、拉非类、西地那非类、伐地那非类和硫代那非类（见表1），建立了前体离子扫描模式测定补肾壮阳类中成药及保健食品中PDE-5 抑制剂的方法，并对重要参数加以讨论。经过实际样品测定验证，该方法既能满足日常检验对已知非法添加物的检测需要，又可筛选出疑似的未知PDE-5 抑制剂的衍生物，为进一步研究鉴定提供方向，大幅提高未知衍生物的检测鉴定效率，也为检测未知的非法添加物提供了新的思路。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo uHPLC／TSQ Quantum Access 三重四极杆质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），Millipore Milli-Q Gradient A10 纯水仪（美国Millipore 公司）。

枸橼酸西地那非（Sildenafil citrate）、他达拉非（Tadalafil）对照品由中国药品生物制品检定研究院提供；那红地那非（Noracetildenafil）、红地那非（Acetildenafil）、氨基他达拉非（Aminotadalafil）、羟基豪莫西地那非（Hydroxyhomosildenafil）、伐地那非二盐酸盐（Vardenafil dihydrochloride）、豪莫西地那非（Homosildenafil）、伪伐地那非（Pseudovardenafil）、硫代艾地那非（Thioaidildenafil）、那莫西地那非（Norneosildenafil）均购于加拿大Toronto Research Chemicals 公司，纯度大于99%。甲醇、乙腈、醋酸铵、冰醋酸均为色谱纯。纯水由Milli-Q 超纯水仪制备。样品:中成药和保健品均为国家抽样样品。所有试剂和样品均需过0.22 μm 滤膜。

1.2 溶液制备

混合对照品储备液:分别精密称取氨基他达拉非和他达拉非对照品各5 mg，其他对照品各1 mg，置于同一10 mL 容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度作为混合对照储备液。临使用前用50%（v／v）乙腈稀释成相应的标准工作液。

质谱参数优化溶液:分别称取各对照品，以初始流动相溶解，并稀释成最终约为5 mg／L 的溶液。

1.3 样品前处理方法

丸剂和胶囊等固体制剂:取多粒研细，混匀，精密称取一次服用量，置于50 mL 量瓶中，加入乙腈约40 mL，超声处理15 min，冷却至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤；精密量取续滤液5 mL，置于10 mL 量瓶中，用50%（v／v）乙腈稀释至刻度。

1.4 液相色谱条件

色谱柱:Poroshell 120 EC-C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国Agilent 公司）；柱温:40℃；流动相A:20 mmol／L 醋酸铵溶液（含0.1%（v／v）醋酸）；流动相B:甲醇-乙腈（25∶15，v／v）；线性梯度洗脱程序:0 ～8.0 min，40% B ～95% B；8.0 ～10.0 min，95% B；10.0 ～10.5 min，95% B ～40%B；10.5 ～13.0 min，40%B。流速:0.3 mL／min；柱温:40 ℃；进样量:5 μL。

1.5 质谱条件

离子化模式:电喷雾离子化正离子模式；毛细管电压:4 kV；锥孔电压:35 V；离子源温度:350 ℃；雾化气压力:241 kPa；辅助气压力:5 arb；氩气碰撞压力:0.2 Pa。

2 结果与讨论

2.1 前体离子扫描模式的建立和优化

2.1.1 PDE-5 型抑制剂的分类和子离子研究

根据结构特征将PDE-5 型抑制剂分为5 类，以最常见的红地那非、他达拉非、西地那非、伐地那非和硫代艾地那非，分别作为红地那非类、拉非类、西地那非类、伐地那非类和硫代西地那非类的代表化合物进行二级子离子的扫描，解析代表化合物的碎片离子，寻找可能的具有母核信息的碎片，并优化这些碎片的二级碰撞能量（CID），拉非类的CID 为15～20 eV，其他的CID 为35 ～40 eV。

结合准确质量和结构通式，各类共有碎片的推断结果如表1 所示。红地那非类共有子离子有m／z 353.160 8、325.129 5、297.129 5；拉非类共有子离子有m／z 262.086 3、135.044 1；西地那非类共有子离子有m／z 377.127 8、311.150 3、299.113 9、283.119 0；伐地那非类除具有西地那非类共有子离子外，还有特征子离子m／z 151.088 6；硫代那非类共有子离子有m／z 393.105 0、327.127 4 和299.096 1。

2.1.2 前体离子扫描范围的设定

前体离子扫描范围影响扫描的速度和灵敏度。根据已知的PDE-5 抑制剂的相对分子质量设定合适的前体离子扫描范围:拉非类前体离子扫描范围为m／z 350 ～500，红地那非类、西地那非类、伐地那非类和硫代那非类前体离子扫描范围为m／z 400 ～600。

2.1.3 共有子离子的选择

以2.1.1 节中各类代表化合物解析出的共有子离子建立前体离子扫描方法（由于本文使用的三重四极杆质谱仪为低分辨质谱，故设定m／z 参数均只保留一位小数），测定11 种对照品（即国家标准中11 种PDE-5 抑制剂）的混合标准溶液，根据各子离子通道总离子流图以及11 种已知化合物的提取离子流图（见图1 和图2），判断各子离子通道的灵敏度和同类化合物子离子碎片的共有性。为了达到专属性要求，每类化合物应选择2 种或2 种以上的子离子。尽管增加子离子的监测数量可以在一定范围内增强筛选的专属性，但可能牺牲三重四极杆前体离子扫描的灵敏度，故每类化合物一般只筛选灵敏度较高的2 个共有子离子。

图1 混合对照溶液的前体离子扫描总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of precursor ion scanning of mixed reference solution

红地那非类共有碎片为m／z 325.1、297.1，拉非类共有碎片为m／z 135.0、262.1，西地那非类共有碎片为m／z 283.1、311.1，伐地那非类特征碎片为m／z 299.1、151.1，硫代那非类共有碎片为m／z 393.1、299.1。其中，西地那非和伐地那非的母核基本相同，碎片也相似，具有许多相同m／z 的共有碎片离子，m／z 283.1、311.1 和299.1 中有2 个即可推断样品中可能含有PDE-5 抑制剂（西地那非类或伐地那非类）；但是由于共轭环上杂原子的位置不同，导致伐地那非的优势裂解与西地那非不同，m／z 299.1 和151.1 的丰度较大，故同时选择以提高伐地那非类的准确度；硫代那非类与西地那非、伐地那非类均具有m／z 299.1 碎片，虽然结构不同、准确质量不同（见表1），但是低分辨的三重四极杆质谱无法区分，故设定合一。最终选择m／z 135.0、151.1、262.1、283.1、297.1、299.1、311.1、325.1 和393.1共9 个子离子建立前体离子扫描方法。

2.2 11 种已知PDE-5 抑制剂的典型色谱图

取1.2 节的系列混合对照品贮备液，以50%（v／v）乙腈稀释成混合对照标准工作液，按照建立的方法进行测定，得到各通道的总离子流图（见图1）。

分别提取相应化合物的前体离子m／z（11 种已知PDE-5 抑制剂的母离子信息见表1），得到9 个子离子通道的提取离子流图（见图2），其中图2a 为红地那非类特征子离子m／z 297.1、325.1 通道的提取离子流图，代表化合物为那红地那非（1）、红地那非（2）；图2b 为拉非类特征子离子m／z 135.0、262.1 通道的提取离子流图，代表化合物氨基他达拉非（3）、他达拉非母离子（4）；图2c 为西地那非类特征子离子m／z 283.1、311.1 通道的提取离子流图，代表化合物羟基豪莫西地那非（5）、西地那非（6）、豪莫西地那非（8）、那莫西地那非（11）；图2d 为伐地那非特征子离子m／z 299.1、151.1 通道的提取离子流图，代表化合物伐地那非（7）、伪伐地那非（9）；图2e 为硫代那非类特征子离子m／z 299.1、393.2 通道的提取离子流图，代表化合物硫代艾地那非（10）。

2.3 11 种已知PDE-5 抑制剂的检出限

取1.2 节的系列混合对照品贮备液，用50%（v／v）乙腈稀释成分别约含拉非类0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5 mg／L，含其他那非类0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5 mg／L 的系列标准工作液，按照建立的方法进行测定，以各化合物检出时对应的各标准溶液浓度为检出限。各子离子通道检测11 种已知PDE-5 抑制剂的检出限结果见表2。

图2 前体离子扫描通道的提取离子流图Fig.2 Extracted ion chromatograms of precursor ion scanning filters

表2 11 种已知PDE-5 抑制剂的检出限Table 2 Limits of detection （LODs）of the 11 known PDE-5 inhibitors

2.4 应用与讨论

用已建立的前体离子扫描方法对实际样品进行筛选，在应用中发现:用质量较低的碎片m／z 135.0、151.1检测拉非类和伐地那非类的灵敏度较高，但选择性较差。因此必须结合该类别选择的另一个特征离子才能更好地判定化合物是否为PDE-5 抑制剂。

图3 为3 份实际样品测定的色谱图，图3a 为样品1 的色谱图，检测到化合物A、B，而经过子离子通道分析可知它们均含有2 个拉非类特征子离子（m／z 135.0、262.1），说明A、B 为拉非类化合物；经对照品确证化合物A、B 分别为氨基他达拉非、他达拉非。图3b 为样品2 的色谱图，检测到C、D 两个化合物，经过子离子通道分析，化合物C 含有西地那非类特征子离子（m／z 283.1、311.1），经对照品确证化合物C 为西地那非；而化合物D 尽管含有拉非类其中的一个特征子离子（m／z 135.0），但是不含有另外的特征子离子（m／z 262.1），说明D 不属于拉非类化合物，是非PDE-5 物质。质荷比较小的碎片虽然常为化合物的优势裂解碎片，灵敏度高，但由于结构较简单，特征性不强，许多化合物都可以产生这些优势碎片，因而专属性较差。在建立前体离子扫描方法时应同时兼顾共有性和专属性，降低假阳性的发生率。图3c 是样品3 的色谱图，可见其没有添加PDE-5，样品为阴性。

对70 批实际抽样样品进行分析，先通过总离子流图判断有无疑似色谱峰，再根据分类检查各类子离子通道检出的一致性。测定结果显示所有阴性样品的总离子流图中均未发现疑似色谱峰，未出现假阴性结果；阳性样品的测定结果与MRM 模式及质谱全扫描模式的检测结果均一致，快速筛查正确率为100%。这说明选择的子离子专属性良好，不易出现假阳性，可同时满足日常检验的要求。

本实验收集的样品中未出现11 种对照化合物以外的新PDE-5 抑制剂衍生物，虽然未能直接证明该方法可筛选出未知PDE-5 抑制剂，但已有许多文献［2，3，10，11］报道在保健食品中发现了非法添加的新衍生物，根据文献给出的新衍生物结构，可以推断大多数新PDE-5 抑制剂的二级质谱应包含本文建立前体离子扫描方法的9 种共有子离子；通过整理文献中明确列举的二级质谱碎片信息，得出有近20 种新衍生物（如表3 所示）具有文中列举的典型碎片，可以归属于本文提出的5 大类PDE-5 抑制剂，说明该方法具有一定的普遍适用性，可推断该方法可以满足这些新衍生物的初步筛选。

表3 其他PDE-5 抑制剂的碎片和分类Table 3 Product ions and types of other PDE-5 inhibitors

表3 （续）Table 3 （Continued）

图3 3 个典型实际样品测定的色谱图Fig.3 Typical chromatograms of three actual samples

3 结论

靶点相同、药理相近的化合物往往具有相似的结构，PDE-5 抑制剂衍生物数量庞大，合成简单，是非法添加的重要药物之一，受到国内外广泛的关注。采用LC-MS／MS 确证和筛选该类化合物已有很多报道，其效果得到普遍认可。三重四极杆质谱不同于离子阱质谱，前者是空间上的串联，后者是时间上的串联，由于三重四极杆质谱特殊的串联方式，使其具有离子阱质谱不具备的一些功能，如母离子扫描、中性碎片丢失扫描等，而人们往往只重视了三重四极杆质谱多反应监测功能，忽略了其他功能［12］。

本研究试图采用母离子扫描功能从复杂的中成药和保健食品中筛选PDE-5 抑制剂。通过对已知PDE-5 抑制剂的结构研究将其分为5 类，选择最常见的5 种已知化合物作为代表，研究其二级质谱裂解规律，推断出各类共有碎片离子，初步建立前体离子扫描方法；用包括代表化合物在内的11 种国家标准中的已知PDE-5 抑制剂再次筛选共有离子，兼顾灵敏度和稳定性，优化方法，并应用于实际样品的筛查测定；通过查阅文献中提供的新衍生物的碎片信息，推断该方法具有较普遍的实用性，可以满足结构相近的未知衍生物的初步筛选。

该方法扫描速度快、效率高、一次扫描同时确定多种结构，尤其适合应对新衍生物的非法添加，为今后非法添加物的检测提供了一种新的思路和手段。

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