金丽，周建丽，张晓丹，古卓良，卜莹

(南京军区联勤部药品仪器检验所，南京 210002)

高效液相色谱手性流动相法测定盐酸肾上腺素注射液中S-对映体含量

金丽，周建丽，张晓丹，古卓良，卜莹

(南京军区联勤部药品仪器检验所，南京 210002)

目的 建立肾上腺素光学异构体中S-对映体的高效液相色谱手性流动相检测方法。方法 Purospher®STAR RP-18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：10 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(含10 mmol·L-1手性添加剂磺丁基-β-环糊精，磷酸调节pH至3.0)-乙腈(98.5：1.5)，流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长280 nm。结果 肾上腺素S-对映体在浓度5.02～501.50 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数0.999 7，检测限0.05 μg·mL-1。结论 该方法重复性、耐用性好，适用于盐酸肾上腺素注射液中S-对映体杂质含量的测定。

肾上腺素注射液，盐酸；色谱法，高效液相；手性流动相；添加剂；S-对映体

肾上腺素为肾上腺素受体激动药，对β1和β2受体均有较强的兴奋作用，临床主要用于心搏骤停、支气管哮喘、过敏性休克，也可用于治疗荨麻疹、枯草热及鼻黏膜或牙龈出血等[1]。盐酸肾上腺素注射液是肾上腺素的主要剂型，为《中华人民共和国药典》(2010年版)收载品种。此外，《美国药典》(USP35)、《英国药典》(BP2010)和《日本药局方》(JP15)中也均有收载。肾上腺素为邻苯二酚结构，结构中有一个手性碳原子，所以有两个手性对映体，即R-对映体和S-对映体，二者与肾上腺素受体的亲和力和内在活性有明显的差异，R-对映体对血管的收缩作用比S-对映体强十几倍[2]。因此，各国药典均采用肾上腺素R-对映体。但肾上腺素在合成过程中可能由于拆分不完全而残留S-对映体；同时随着贮藏时间的延长，注射液中的肾上腺素在也会发生消旋化反应而产生S-对映体，这都会导致肾上腺素的药理活性下降[3]。因此，有必要对盐酸肾上腺素注射液中S-对映体的含量加以控制。目前，肾上腺素对映体的拆分以毛细管电泳法和高效液相色谱法为主[3-5]，但研究多侧重于肾上腺素消旋体的拆分方法，仅金微等[6]报道毛细管电泳法对不同盐酸肾上腺素注射液中S-对映体含量的测定。笔者针对基层检验单位的实际情况，采用应用更广的高效液相色谱法以含有手性添加剂流动相测定盐酸肾上腺素注射液中S-对映体的含量，并对国内7个厂家的101批次产品的S-对映体含量进行分析考察，以期为盐酸肾上腺素注射液的质量评价提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100 型高效液相色谱仪：包括二元泵、光电二极管阵列检测器、Chem Station 色谱数据工作站(美国安捷伦公司)；PHS-3C型酸度计(上海精密仪器厂)；MS105电子天平、AL104电子天平(Mettler Toledo)。

1.2 试药 盐酸肾上腺素(盐酸肾上腺素R-对映体)注射液(来自国内7个厂家，共101批次，规格：1 mg：1 mL)；盐酸肾上腺素消旋体(R，S-对映体)(Sigma-Aldrich公司，批号：SLBG5626V，纯度以100%计)；肾上腺素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100154-201104，纯度：99.7%)；磺丁基-β-环糊精(SBE-β-CD，西亚试剂公司，批号：F2503，纯度：98%)；磷酸、磷酸二氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、盐酸均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为新制重蒸水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 系统适用性溶液 称取盐酸肾上腺素消旋体适量(相当于肾上腺素消旋体10 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，加水适量使溶解并定容，摇匀，即得。

2.1.2 肾上腺素对照品溶液 称取肾上腺素对照品(R-对映体)约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加稀盐酸1 mL使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液 取规格为1 mg：1 mL的盐酸肾上腺素注射液直接测定。

2.2 色谱条件与系统适用性

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Purospher®STAR RP-18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：10 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(含10 mmol·L-1磺丁基-β-环糊精，用磷酸调节pH至3.0)-乙腈(98.5：1.5)；流速0.8 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。

2.2.2 系统适用性 在上述色谱条件下，肾上腺素R-对映体和S-对映体分离度良好(Rs>1.9)，理论板数按R-对映体计>9 000，见图1。

2.3 线性关系考察 精密称取盐酸肾上腺素消旋体120.3 mg(相当于肾上腺素消旋体100.3 mg)置100 mL量瓶中，加水适量使溶解，并定容，摇匀，制成1.003 mg·mL-1肾上腺素消旋体贮备液。分别精密量取储备液1，2，4，10，20，40 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得梯度浓度分别为5.02，10.03，20.06，50.15，100.30，200.60，501.50 μg·mL-1的肾上腺素S-对映体溶液。采用“2.2.1”项色谱条件测定，记录色谱图。以色谱图中肾上腺素S-对映体的峰面积(A)对其浓度(C)进行线性回归，得线性方程和相关系数分别为：A=13.351C-26.876，R2=0.999 7。肾上腺素S-对映体在浓度5.02～501.50 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，适合于低浓度范围S-对映体杂质的检测。

2.4 检测限 精密量取“2.3”项肾上腺素消旋体贮备液逐级定量稀释，进样并记录色谱图，按信噪比(S/N)为3计算检测限。S-对映体的最低检测浓度为0.05 μg·mL-1。

2.5 重复性与稳定性实验 取供试品溶液按“2.2.1”项色谱条件重复测定6次，按归一化法计算供试品中肾上腺素S-对映体的平均含量为1.51%，RSD为0.25%。结果表明该方法的重复性良好。取供试品溶液按“2.2.1”项色谱条件在0，4，8，12，24 h测定，按面积归一化法计算供试品中肾上腺素S-对映体含量的RSD为0.98%。结果表明供试品溶液在24 h内有较好的稳定性。

Fig.1 Chromatograms of(±)epinephrine hydrochloride(A)，epinephrine standard(B)and epinephrine hydrochloride injection(C)

2.6 耐用性考察 取供试品溶液按“2.2.1”项下色谱条件，再选择Shim-pack VP-ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱测定S-对映体的含量，计算两种色谱柱测得S-对映体含量的RSD为1.25%。结果表明该方法具有较好的耐用性。

2.7 样品S-对映体含量的测定 对101批次盐酸肾上腺素注射液按“2.2.1”项色谱条件逐批检测，按面积归一化法计算S-对映体的百分含量，结果见图2。S-对映体的百分含量范围为1.31%～9.15%。

图2 7家企业101批次盐酸肾上腺素注射液中S-对映体的百分含量

Fig.2 Percentage ofS-isomer in 101 batches of epinephrine hydrochloride injections from 7 manufacturers

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 手性添加剂浓度的优化 手性添加剂的浓度是影响肾上腺素R、S-对映体分离的一个重要的因素，通过调整手性添加剂的浓度，可使R、S-对映体达到最佳分离。在乙腈-10 mmol·L-1的磷酸二氢钠缓冲液中(用磷酸调节pH3.0)添加SBE-β-CD，使其浓度分别为2.5，5，10和20 mmol·L-1。实验结果表明，在一定范围内，当SBE-β-CD浓度逐渐加大时，R、S-对映体的保留时间随之增加，同时分离度随之增大。考虑到SBE-β-CD浓度过大对色谱柱损伤较大且流动相也更易霉变，故最终选择10 mmol·L-1的SBE-β-CD作为手性添加剂的浓度。

3.1.2 缓冲液pH的优化 用磷酸将含10 mmol·L-1SBE-β-CD的10 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液调至不同的pH：2.0，2.5，3.0，3.5，分离肾上腺素R、S-对映体。结果表明：在pH 2.0～3.5范围内，随着pH的增大，R、S-对映体的保留时间呈增加趋势，而分离度变化不明显。考虑pH较高时，R、S-对映体保留时间过长，本研究选择pH3.0的10 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(含10 mmol·L-1SBE-β-CD)-乙腈(98：5：1.5)为流动相。

3.2 样品结果分析 101批次盐酸肾上腺素注射液中均检出S-对映体，含量为1.31%～9.15%。其中1家公司(简称为A公司)产品的S-对映体的含量均>6%(n=25)，1家公司(简称为B公司)产品的S-对映体含量均<3%(n=27)。比较两公司产品的pH发现，A公司的产品(pH均值为3.0，n=25)的pH低于B公司产品(pH均值为3.5，n=27)，表明产品pH与S-对映体的含量有一定的相关性。按“2.2.1”项下色谱条件测定不同pH值的模拟盐酸肾上腺素注射液中S-对映体含量。结果pH在3.5～5.5之间，肾上腺素较为稳定，在pH3.5以下和pH5.5以上肾上腺素的消旋化反应速度加快，pH2.5时制剂中S-对映体的含量明显增加，说明注射液的pH值过高或过低都不利于肾上腺素的稳定。

比较7家公司的处方组成与S-对映体含量的关系：抗氧剂焦亚硫酸钠或亚硫酸钠用量约为0.1%，且添加螯合剂EDTA的产品，各批次S-对映体含量均<3%；抗氧剂使用量正常，未添加螯合剂EDTA的产品，各批次S-对映体含量均>3%；抗氧剂使用量仅为0.03%，且添加螯合剂EDTA的A公司产品，各批次S-对映体含量均>6%。结果表明抗氧剂焦亚硫酸钠(或亚硫酸钠)和螯合剂EDTA有助于注射液中R-对映体的稳定，对肾上腺素的消旋化有一定的抑制作用。

[1] 宋冬梅，任美婷，段更利.肾上腺素原料药及盐酸肾上腺素注射液杂质的HPLC-QTOF MS分析[J].药物分析杂志，2012，32(8)：1468-1470，1452.

[2] 林美新，陈必钦，李忠琴，等.生物转化体系中R肾上腺素光学纯度的测定[J].分析科学学报，2010，26(4)：395-399.

[3] 李桦，罗维，胡先明.高效液相色谱法测定肾上腺素的光学纯度[J].色谱，1999，17(4)：403-405.

[4] 王维庭，贾庆文，庄严，等.毛细管电泳法拆分肾上腺素手性对映体[J].中国当代医药，2010，17(17)：125-127.

[5] 李桦，胡先明，谢颖峰.高效液相色谱手性流动相添加剂分离肾上腺素类对映体[J].色谱，1998，16(5)：424-426.

[6] 金薇，彭兴盛，江文明，等.盐酸肾上腺素注射液中S-对映体的测定及稳定性考察[J].药物分析杂志，2012，32(2)：273-276.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.026

Determination ofS-isomer in Epinephrine Hydrochloride Injection by HPLC with Chiral Mobile Phase Additives

JIN Li, ZHOU Jianli, ZHANG Xiaodan, GU Zhuoliang, BU Ying

(TheInstituteofQualityControlofMedicalMaterialandEquipmentundertheJointLogisticDepartmentofNanjingCommand,Nanjing210002,China)

Objective To establish a method for the chiral separation and determination ofS-isomer in epinephrine hydrochloride injection by HPLC with chiral mobile phase additives. Methods Column of Purospher®STAR RP-18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used.The mobile phase was acetonitrile-10 mmol·L-1sodium dihydrogen phosphate buffer containing 10 mmol·L-1sulfobutylether-β-cyclodextrin (pH adjusted to 3.0 with phosphoric acid) (98.5：1.5), detection wavelength was 280 nm, the flow rate was 0.8 mL·min-1, and the column temperature was 30 ℃. Results Good linear relationship was established between the peak area and the concentration ofS-isomer over the range of 5.02-1501.50 μg·mL-1(R2=0.999 7).The detection limit was 0.05 μg·mL-1. Conclusion The proposed method shows high repeatability and durability.It can be employed for the quality control ofS-isomer in epinephrine hydrochloride injection.

Epinephrine injection, hydrochloride；Chromatography, high performance liquid； Chiral mobile phase； Additives；S-isomer

2014-02-28

2014-07-21

金丽(1976-)，女，江西南昌人，副主任药师，博士，研究方向：药物分析。电话：025-80867152-8015，E-mail：mailjinli@sohu.com。

卜莹(1978-)，女，江苏扬州人，副主任药师，硕士，研究方向：药物分析。电话：025-80867169，E-mail：buyouyou@126.com。

R971.3；R927.2

A

1004-0781(2015)06-0799-03