王 涛，刘跃华，郑和义，左亚刚，方 凯

中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院皮肤科，北京，100730)

*通信作者(corresponding author):yuehualiu@263．net

BCL-2基因是与细胞凋亡关系密切的原癌基因之一。BCL-2/IgH融合基因可导致BCL-2蛋白的过度表达，可能是淋巴瘤发病和发展的机制之一。既往有研究显示，BCL-2/IgH在淋巴瘤的辅助诊断、检测疗效、评估化疗、预防复发和评估预后等方面有重要的作用。紫外线光疗治疗蕈样肉芽肿(Mycosis Fungoides，MF)引起的BCL-2蛋白表达下降究竟是由于何种机制所致，目前并不清楚。有研究显示光疗后早期MF患者皮损组织中BCL-2蛋白表达显著下降。但有作者认为补骨脂联合紫外线A治疗(Psoralen plus Ultraviolet A，PUVA)治疗后MF皮损组织中BCL-2蛋白变化与临床和病理改变并不相关［1］。综上，针对光疗后MF组织中BCL-2变化的更深入的研究很有必要，检测BCL-2/IgH是否在MF患者体内高表达，甚至光疗前后其表达变化与否值得深究。

本研究采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测早期MF经紫外线光疗前后BCL-2/IgH融合基因出现的可能变化，探索此方法在评价光疗疗效和预后的可能性。

1 材料与方法

1.1 对象:24例早期MF患者经PUVA或NB-UVB及PUVA治疗缓解后联合NB-UVB等3种治疗前后48份皮损处石蜡包埋组织标本。

以正常人DNA模板为阴性对照，以β-actin为内参照，以预实验中阳性标本为阳性对照。

1.2 主要试剂盒及来源:FFPE DNA Kit(CW547，康为世纪公司);SYBR® Premix EX TaqTM和 ROX Reference Dye(×50)(TaKaRa)。

1.3 方法:用荧光定量PCR检测BCL-2/IgH融合基因。根据试剂盒说明配制PCR反应体系。1)荧光定量PCR反应体系(冰上配制，20μL)及引物序列，BCL-2/IgH引物序列按照文献报道［2］由生工生物工程(上海)有限公司合成，内参基因β-actin引物序列由赛百盛基因技术有限公司合成。2)荧光定量 PCR反应:预变性95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃30 s，循环数60个;变性95℃ 15 s，退火延伸60℃ 1 min，95℃ 15 s;熔解曲线程序:95℃ 15 s，50℃ 15 s，95℃ 15 s。每个标本对应于每个基因，重复3次。

1.4 统计学分析:以同一个样本目的基因Ct值与β-actin Ct值的差值△Ct，即△Ct=Cttarget－ Ctβ-actin，得出目的基因在同一对标本治疗前后表达的倍数关系，即Ntarget=2－(△Ctpro－△Ctpost)，当Ntarget≥2时被认为治疗前相对于对应治疗后高表达，而当Ntarget≤1/2时，则认为治疗前相对于治疗后目的基因表达下调。设定正常对照者CT均值为设定的检测限，研究方法检测的假阳性率为0，样本CT值大于或等于正常对照者设为阴性表达，小于者为阳性表达。荧光定量PCR结果采用Fisher's确切概率法或t检验，相关性分析采用Pearson卡方检验分析R值。

2 结果

共20例患者DNA及RQ-PCR均取得预期值。治疗前后早期MF患者皮损中BCL-2/IgH扩增前后无差异。治疗前BCL-2/IgH阳性者为4例，治疗后为3例，治疗前后阳性率无差异;N值与复发率相关性分析:N≥2者与治疗有效与否无相关性;N≤1/2者与治疗复发与否无相关性(表1、2，图 1)。

3 讨论

本研究治疗前BCL-2/IgH融合基因阳性率仅为20%，与既往研究结果类似［3］。早期MF患者经紫外线光疗后，BCL-2/IgH相对的基因拷贝数可出现显著性变化，但治疗后出现BCL-2/IgH高表达者，与复发率之间无相关性，而治疗后拷贝数下调，与疗效之间无相关性。这种现象说明，光疗后早期MF患者体内BCL-2蛋白表达下降可能是肿瘤细胞减少后的非特异性结果，出现这种下调的原因可能不是光疗引起BCL-2/IgH融合基因变化，可能还存在其他的机制而导致光疗后BCL-2蛋白表达下降而下调其诱导的抗凋亡作用。也说明BCL-2/IgH融合基因不适合作为监测紫外线光疗治疗早期MF病情变化、疗效评价和监测预后的指标。

表1 BCL-2/IgH扩增结果Table 1 Amplification results of BCL-2/IgH(x±s，n=20)

表2 ΔCT值及N值Table 2 Value ofΔCT and N(x±s，n=20)

图1 溶解曲线Fig 1 Solubility curve

［1］Weshahy H，Mahgoub D，El-Eishy N，et al．BCL-2 expression in mycosis fungoides before and after PUVA therapy［J］．Photodermatol Photoimmunol Photomed，2010，26:107－109．

［2］张学美，徐明，刘华，等．实时定量PCR法检测淋巴瘤患者BCL-2/IgH融合基因及其临床意义［J］．中国实验血液学杂志，2009:368－372．

［3］Garcia MJ，Martinez-Delgado B，Granizo JJ，et al．IgH，TCR-gamma，and TCR-beta gene rearrangement in 80 B-and T-cell non-Hodgkin's lymphomas:study of the association between proliferation and the so-called“aberrant”patterns［J］．Diagn Mol Pathol，2001，10:69－77．