吴群励，张 宏，朴元林，屈 岭，孙连庆，王普艳，石 玥，高云周，梁晓春*

(1.北京协和医学院 中国医学科学院 北京协和医院中医科 转化医学中心， 北京 100730；中国医学科学院 基础医学研究所 2.细胞中心；3.病理中心， 北京 100005)

研究论文

筋脉通胶囊通过增强背根神经节Nrf2和HO-1的表达改善糖尿病大鼠的周围神经痛

吴群励1，张 宏2，朴元林1，屈 岭1，孙连庆1，王普艳1，石 玥1，高云周3，梁晓春1*

(1.北京协和医学院 中国医学科学院 北京协和医院中医科 转化医学中心， 北京 100730；中国医学科学院 基础医学研究所 2.细胞中心；3.病理中心， 北京 100005)

目的观察中药筋脉通胶囊对链尿佐菌素(STZ)诱导的糖尿病(DM)大鼠背根神经节(DRG)的核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达以及血浆一氧化碳(CO)含量的影响。方法腹腔内注射STZ诱导建立DM大鼠模型，随机分为模型组、筋脉通小、中和大剂量组及硫辛酸组，并设对照组。成模后每天1次灌胃给药，持续12周。电子Von Frey仪检测机械痛阈值，免疫组化法及Rt-PCR检测DRG的Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表达，并检测血浆一氧化碳血红蛋白(COHb)含量。结果与对照组相比，糖尿病大鼠的机械痛阈值、血浆COHb含量以及DRG的Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表达水平均明显下降(Plt;0.01)；各治疗组的上述指标均显著回升(Plt;0.01或Plt;0.05)。在提高DRG的HO-1蛋白表达上，筋脉通中剂量组疗效显著优于硫辛酸组(Plt;0.05)。结论筋脉通胶囊可通过增强DRG的Nrf2、HO-1和CO表达来改善糖尿病大鼠的周围神经痛。

糖尿病周围神经病变；核因子E2相关因子2；血红素加氧酶-1；一氧化碳；筋脉通

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)的发病率高达50%以上，而50%以上的DPN患者具有疼痛症状，极大影响生活质量[1]。目前有关糖尿病神经痛的确切病理生理机制尚未清楚。研究证实高血糖与神经缺血可引起氧化应激，产生过多的活性氧和活性氮，损害线粒体，损伤脂质、蛋白质和DNA，破坏细胞的正常功能和完整性，造成轴突变性和死亡以及神经纤维的功能减退、损害和缺失，与DPN的发生、发展密切相关。核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)为细胞防御多种应激损伤的关键因子，是诱导Ⅱ相酶基因表达的必需调节因子。Ⅱ相酶中的血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)及其降解产物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、促血管生成等多重生物活性，被认为是体内的天然防御系统。大量研究表明Nrf2/HO-1/CO系统的激活，可改善氧化应激诱导的胰岛素抵抗，纠正高糖导致的组织细胞生化机能紊乱，延缓糖尿病及其并发症的发生[2-5]。临床证实中药筋脉通胶囊可有效改善糖尿病患者的疼痛症状[6-7]。本研究观察了筋脉通胶囊对STZ-DM大鼠背根神经节(DRG)的Nrf2和HO-1的表达以及血浆CO含量等的影响，进一步探讨其防治DPN的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：清洁级雄性SD大鼠，体质量240～280 g[北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SXCK(京)2007-0001]。

1.1.2 主要药物和试剂：筋脉通胶囊(JMT)，中国医学科学院北京协和医院院内制剂(北京九龙制药厂加工生产,每粒含生药0.35 g)。硫辛酸胶囊(山东齐都药业有限公司，0.3 g/粒)，精蛋白锌胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司,400 U/10 mL)。STZ、兔抗鼠Nrf2和HO-1多克隆抗体(Sigma公司)，超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、RealSuper Mixture(with Rox)、DNase 1及Nrf2、HO-1引物设计(北京康为世纪生物科技有限公司)，SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组给药：大鼠适应性饲养1周，常规复制DM模型。根据随机数字表将DM大鼠分为5组:模型(Model)组和筋脉通小、中、大剂量组(分别为JMT-L、JMT-M和JMT-H,按成人剂量的5、10和20倍给药)及硫辛酸组(TAC, 按成人剂量的10倍给药)，每组各10只。以体质量、鼠龄相匹配的正常大鼠10只作为对照(conrol)组。DM大鼠每天皮下注射精蛋白锌胰岛素注射液1～4 U，维持血糖在20～25 mmol/L，防止因血糖过高无法存活至实验终点。成模后即开始灌胃给药，每天1次，连续12周。模型组和对照组灌服蒸馏水10 mL/(kg·d)。

1.2.2 检测血糖及体质量：于灌胃前及灌胃不同时间称重并用罗氏血糖仪测定尾尖血血糖。

1.2.3 检测机械痛阈值：在安静环境中，将大鼠单独置入多孔钢丝笼中。待大鼠适应环境15 min后，以电子von Frey刺激针刺激大鼠后肢足底中部，力度由小到大逐渐增加，当大鼠出现缩足反应时，记录von Frey电子记录仪上显示的压力数值。每只大鼠刺激3次，间隔时间大于30 s，取平均值作为大鼠的机械痛阈值。

1.2.4 检测血浆COHb含量：腹腔注射12%乌拉坦(10 mL/kg)麻醉大鼠，取颈动脉血用生化法测定血浆CO水平[8]。在420和432 nm两个波长测定吸光度值，依比尔定律建立方程式，求出COHb的百分含量(代表内源性CO水平)。

1.2.5 免疫组化法检测背根神经节Nrf2和HO-1蛋白的表达：心脏灌注4% 多聚甲醛约40 min，取与坐骨神经相关的双侧第4、5和6背根神经节，常规制片，按试剂盒说明书操作，检测Nrf2和HO-1的表达。镜检呈棕黄色者为阳性表达。Leica DM3000显微镜及其图像采集系统采集图片，Image-ProPlus 6.0图像分析软件分析图片。每组随机取5只大鼠，每只大鼠观察2张切片，每张切片在200倍光镜下选取5个互不重叠视野，测量积分吸光度(IA) 值，取均值作为1只大鼠的结果。

1.2.6 荧光定量PCR检测背根神经节Nrf2和HO-1的mRNA表达：迅速取下背根神经节，置于-80℃液氮保存。按照说明书用超纯RNA提取试剂盒提取总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳示28 s、18 s和5 s条带清晰，紫外分光光度计检测A260/280比值为1.8～2.0。用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，合成的cDNA用AB7500型荧光定量PCR仪进行PCR循环，采用2-△△CT法进行数据分析。每组随机取5只大鼠，每份样品均做3个复孔，另加3个无模板的阴性对照，取均值作为1只大鼠的检测结果。引物序列为: Nrf2上游5′-GGACCTAAAGCA CAGCCAACACAT-3′，下游5′- TCGGCTTGAATGTTT GTCTTTTGTG-3′，扩增片段177 bp；HO-1上游5′-CT TTTTTCACCTTCCCGAGCATC-3′,下游5′-GGTCTTA GCCTCTTCTGTCACCCTGT-3′，扩增片段122 bp；内参照GAPDH上游5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′,下游5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′，扩增片段138 bp。反应体系为20 μL:cDNA 2 μL，引物上下游各0.4 μL，REALSYBR Mixture(×2)10 μL，水7.2 μL。扩增程序为：95 ℃ 10 min，(95 ℃15 s，60 ℃ 60 s)×40个循环。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血糖和体质量的变化

对照组大鼠一般情况良好；模型组大鼠出现多饮、多食和多尿，精神萎靡，活动减少和白内障；各治疗组大鼠皆有类似模型组的表现，但程度较轻。模型组血糖显著升高而体质量显著下降(Plt;0.01)，各治疗组未能缓解上述变化。

2.2筋脉通胶囊能提高糖尿病大鼠的机械痛阈值和血浆CO水平

模型组DM大鼠的机械痛阈值和血浆CO水平较对照组明显降低(Plt;0.01)，各治疗组的机械痛阈值和血浆CO水平显著回升(Plt;0.01)，但仍低于对照组(Plt;0.01)；JMT-M组的机械痛阈值较JMT-H组回升更高(Plt;0.05)(表1)。

表1 各组大鼠机械痛阈值和血浆COHb含量的比较

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.01 compared with model；△Plt;0.05 compared with JMT-M.

2.3筋脉通胶囊能提高糖尿病大鼠背根神经节Nrf2蛋白及其mRNA的表达水平

模型组背根神经节Nrf2的IA值较对照组显著降低(Plt;0.01)；各治疗组的IA值显著回升(Plt;0.01)；与TAC组相比，JMT各剂量组的IA值显著增加(Plt;0.01或Plt;0.05)，其中JMT-M组高于JMT-L和JMT-H组(Plt;0.05)。模型组背根神经节Nrf2的mRNA表达水平均较对照组显著下降(Plt;0.01)；各治疗组显著回升(Plt;0.01)(表2，图1)。

2.4筋脉通胶囊能提高糖尿病大鼠背根神经节HO-1蛋白及其mRNA的表达水平

模型组背根神经节HO-1蛋白及其mRNA表达水平较对照组明显降低(Plt;0.01)；各治疗组显著回升(Plt;0.01或Plt;0.05)，其中JMT-M组HO-1的IA值高于TAC组和JMT-H组(Plt;0.05)(表3，图2)。

表2 各组大鼠背根神经节Nrf2蛋白及其mRNA表达结果的比较

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.01 compared with model；▲Plt;0.05，▲▲Plt;0.01 compared with TAC；△Plt;0.05 compared with JMT-M.

表3 各组大鼠背根神经节HO-1蛋白及其mRNA表达结果的比较

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05，##Plt;0.01 compared with model；△Plt;0.05 compared with JMT-M.

图1 大鼠各组DRG的Nrf2免疫组化表达Fig 1 Immunohistochemical expression of Nrf2 in different group rats’ DRG(×20)

3 讨论

疼痛是DPN患者最常见、最突出的症状和首要就诊原因[1]。本研究结果显示STZ诱导后12周，糖尿病大鼠的机械痛阈值较正常大鼠明显降低，提示SD大鼠存在疼痛超敏，DPN造模成功。众所周知DPN的发病机制十分复杂的，是多重致病因素共同作用的结果。其中神经氧化应激因与代谢途径的多元醇通路、己糖胺通路、PKC通路、AGEs通路和PARP通路等相互影响，认为是DPN神经血管功能障碍的中心病理机制。抗氧化应激治疗是防治DPN的有效途径之一[2-5]。

Nrf2是近年来新发现的一种核转录因子，以Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的转录，被认为是细胞抗氧化机制中的最重要通路。受到ROS或亲核物质刺激时，在激酶通路包括MAPK、PI3K和PCK等的参与下，Nrf2从Keap1上解藕联，游离的Nrf2进入核内，从而激活Nrf2信号通路，启动下游抗氧化蛋白基因如Ⅱ相解毒酶、超氧化物歧化酶、抗氧化酶、谷胱甘肽合成代谢相关酶等的转录[2]。血红素加氧酶属于Ⅱ相解毒酶，是一种血红素降解的起始酶和限速酶，催化血红素在体内氧化分解为胆绿素、CO和Fe2+，随之胆绿素迅速还原成胆红素，铁离子诱导铁蛋白的合成。人体内有诱导型HO-1及组成型HO-2和HO-3这3 种HO同工酶。CO在细胞内形成，发挥生物学效应后弥散入血，一部分由肺排出体外，另一部分则以COHb的形式存在，因此可以通过测定血中COHb浓度来间接反应HO-1的活性[8]。许多研究表明，HO-1及其降解产物CO均具有细胞保护、抗氧化、抗凋亡、促血管生成和抗炎的作用[3-5]。

图2 大鼠各组DRG的HO-1免疫组化表达Fig 1 Immunohistochemical expression of HO-1 in different group rats’ DRG(×20)

Nrf2及HO-1是防治DM及DPN等DM慢性并发症的新靶点[2,5,9]。SD大鼠坐骨神经的Nrf2及HO-1表达水平均较正常鼠明显下降[2]。本研究结果显示SD大鼠DRG的Nrf2、HO-1的蛋白及其mRNA表达水平以及血浆CO含量均较正常大鼠显著下降，这与上述研究结果类似。有研究证实HO-1/CO通路的激活，可通过抗炎和抗氧化机制，减轻大鼠的外周神经痛[10]；而Nrf2可通过上调HO-1的表达，减轻甲醛诱导的小鼠外周神经炎性疼痛[11]。提示Nrf2/HO-1/CO表达水平的下降，是导致DPN外周神经痛的可能病理机制。研究发现JSH-23(NF-κB抑制剂)能够通过增加Nrf2与HO-1的表达，降低炎性反应对坐骨神经的损害，提高SD大鼠的神经传导速度，改善其神经血流缺陷和机械痛阈；褪黑素和萝卜硫素能够通过提高Nrf2与HO-1的表达，降低SD大鼠坐骨神经异常增高的NF-κB和促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2)水平，减少氧化应激导致的DNA断裂[2]。目前尚未见中药复方对DPN时Nrf2/HO-1系统影响的研究报道。

既往研究表明，筋脉通能明显改善DPN患者的临床症状、神经体征和神经传导速度[6-7]；改善STZ-DM大鼠坐骨神经的病理形态学异常，减少NF-κB的异常高表达[12]；其含药血清可抑制高糖培养雪旺细胞的NF-κB及其mRNA的表达[13]。α硫辛酸具有抗氧化作用，能改善糖尿病周围神经病变的疼痛超敏状态及神经功能[14]，故本研究以硫辛酸胶囊作为阳性对照药。研究显示，小、中、大剂量的筋脉通胶囊同硫辛酸胶囊一样，均能显著升高SD大鼠的机械痛阈值，增加血浆COHb含量，上调DRG的Nrf2及HO-1的蛋白及其mRNA表达水平。在提高DRG的HO-1蛋白表达上，筋脉通中剂量组的疗效显著优于硫辛酸组。表明筋脉通胶囊具有增强STZ-DM大鼠DRG的Nrf2、HO-1和CO表达的作用，且疗效优于硫辛酸。筋脉通中剂量组较大剂量组能显著升高糖尿病大鼠的机械痛阈值、增强DRG的Nrf2和HO-1表达，表明筋脉通胶囊的3个剂量组中，中剂量组的疗效最好。

综上所述，本研究推测认为STZ-DM大鼠的周围神经痛觉减低与其背根神经节的Nrf2、HO-1和CO的表达降低有关；中药筋脉通胶囊可通过增强背根神经节的Nrf2、HO-1和CO的表达来改善其痛觉异常。有关Nrf2/HO-1/CO通路的具体调节机制以及它们对DM、DPN的影响迄今尚未完全阐明，故筋脉通究竟是如何上调DPN时异常降低的Nrf2/HO-1/CO活性，仍有待于今后进一步深入研究。

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Jinmaitong capsule can ameliorate the peripheral neuropathic pain of STZ-DM rats by enhancing the expressions of Nrf2 and HO-1 in DRG

WU Qun-li1, ZHANG Hong2, PIAO Yuan-lin1, QU Ling1, SUN Lian-qing1, WANG Pu-yan1, SHI Yue1,GAO Yun-zhou3, LIANG Xiao-chun1*

(1.Dept. of Traditional Chinese Medicine, PUMC Hospital Beijing 100730;2.Dept. of Cell Biology; 3.Dept. of Pathology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo study the effects of Jinmaitong Capsule (JMT) on the expression of nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2) and haem oxygenase-1 (HO-1) and their mRNAs in dorsal root ganglion (DRG) and the level of plasma carbon monoxide (CO) in STZ-induced diabetic rats.MethodsSTZ-induced diabetic rats were randomly divided into 5 groups including model group, low-dose JMT group, middle-dose JMT group, high-dose JMT groupand Thioctic Acid Capsule (TAC) group. Ten normal rats matching with weight and age served as the control group. All rats were treated by intragastric administration for 12 weeks and then culled. The mechanical withdrawal threshold was tested by electronic Von Frey instrument before death. The expressions of Nrf2 and HO-1 and their mRNAs in DRG were detected by SABC immunohistochemical method and real-time fluorogenetic quantitative PCR

respectively. The content of plasma COHb was also measured.ResultsCompared with the control group, the mechanical withdrawal threshold, the content of plasma CO and the expressions of Nrf2 and HO-1 and their mRNAs in DRG of all the diabetic rats groups decreased significantly (Plt;0.01). All the above-mentioned indexes in treatment groups raised strikingly (Plt;0.05 orPlt;0.01). The middle-dose JMT group was more effective than the TAC group in enhancing the expression of HO-1 in DRG (Plt;0.05).ConclusionsJinmaitong Capsule can ameliorate the peripheral neuropathic pain of STZ-DM rats by enhancing the expressions of Nrf2, HO-1 and CO in DRG.

diabetic peripheral neuropathy; nuclear factor-E2-related factor 2; haem oxygenase-1; carbon monoxide; Jinmaitong capsule

2013-11-21

2013-12-13

国家自然科学基金(81001580)

*通信作者(correspondingauthor)： xcliang@vip.sina.com

1001-6325(2014)02-0179-06

R285.5

A