曾 彬，王艾力，彭小凡，李 昌

(1.武汉大学人民医院心血管内科，湖北武汉430060;2.中南医院心血管内科超声心动室，湖北武汉430071;3.武汉大学2008级临床医学五年制2班，湖北武汉430060;4.湖北省中山医院心内科，湖北武汉430033)

随着对细胞移植与基因治疗结合的研究，骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)作为外源性治疗基因的载体而被关注［1］。一些研究表明供体细胞在移植前的基因修饰可使其获得更高的移植存活率及增强随后发挥的综合生物学作用。譬如:用抗凋亡基因Bcl-2修饰过的MSCs可以提高移植MSCs在急性心肌梗死后心肌的生存率，改善左室心肌重塑及左室心功能［2］。然而，对于局部血流灌注未恢复的缺血心肌来说，单纯提高移植细胞存活率并没有很大的意义，尤其是对于患者的远期预后。

血红素氧合酶-1(heme oxygenase，HO-1)是血红素分解代谢的起始酶和限速酶，能催化血红素降解为一氧化碳(CO)、亚铁离子(Fe2+)和胆红素，后者迅速降解为胆绿素。最近已经有研究证明了HO-1在血管再生方面的重要作用［3－4］。然而，MSCs介导的 HO-1是否对血管再生产生影响仍然不得而知。

1 材料与方法

1.1 MSCs的分离、纯化、扩增培养和腺病毒转染

无菌条件下采集16～18周龄 Wistar大鼠的双侧胫、股骨骨髓，密度梯度法分离 MSCs，以细胞数1×105个/mL密度接种于塑料培养瓶，DMEM/F12+20%胎牛血清、37℃、5%CO2条件下培养，细胞培养至70% ～80%汇合时，更换无血清培养基;按感染复数值200加入Adv-HO-1(由台湾中央研究院李梅芳博士馈赠，携带绿色荧光蛋白)，37℃孵育2 h加入新鲜的培养基，5% CO2、37℃ 条件下培养［5］。

1.2 心肌梗死模型的制备与细胞移植及分组处理

给大鼠联合20% 乌拉坦(150 mg/kg)与1.5%戊巴比妥(10 mg/kg)腹腔注入麻醉，呼吸机正压辅助呼吸;于大鼠左侧第4肋间横切口开胸，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2 mm处用5-0无损伤线结扎左冠脉前降支，造成心肌梗死。筛选成功心肌梗死模型大鼠36只，分成3组，每组12只。于大鼠心梗后1 h，直视下于梗死心肌周围用微量注射器分5点分别注射HO-1-MSCs，GFP-MSCs(5 × 106个/100 μL)［5］，关胸，维持辅助呼吸至自主呼吸恢复，送回笼中精心饲养。注射PBS为对照组。

1.3 Western blot检测HO-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的表达

梗死区周边心肌组织提取蛋白后电泳分离，转膜，一抗为 HO-1兔抗鼠多克隆抗体，或促凋亡蛋白Bax兔抗鼠多克隆抗体;二抗为辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体，ECL反应溶液底片显影，扫描底片。

1.4 RT-PCR检测

移植1周后切除大鼠心脏，用试剂盒(Invitrogen公司)从心肌梗死灶周边区域提取所有RNA，按照前述方法进行 RT-PCR，β-actin为内参。Human HO-1的引5'-CAGGCAGAGAATGCTGAGTTC-3'(正义)，5'-GATGTTGAGCAGGAACGCAGT-3'(反义)。反应条件β-actin:94℃解链，54℃退火，72℃延伸90 s。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。凝胶扫描分析计算目的带A值，以β-actin为参照，计算相对A值。

1.5 毛细血管密度的测定

移植4周后，取梗死区周边组织，制作石蜡组织块后垂直于其长轴连续切片，每隔1 mm切片一张，厚度为6 μm。采用 CD34相关抗原二步法，先加CD34多克隆抗体，再加通用型二抗，DAB染色，显微镜下观察，控制反应时间在5～10 min，冲洗，苏木素复染、水性封片剂封片。每张切片随机取5个200倍视野，计算每个视野内毛细血管的数目，取平均值即为毛细血管密度。

1.6 TUNEL染色检测

实验步骤按原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行。切片脱腊水化，室温下30 mL/L甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10 min;蛋白酶K(20 mg/L于10 mol/L Tris2 HCl pH 8.0)溶液，37℃消化30 min;加 1 mL/L Triton X2100，4 ℃，8 min;湿盒中样本上加入TUNEL反应液50 μL(1液和2液1∶9混合，用前现配)，37℃，孵育60 min(黑暗处)。样本上加入Converter-AP，放入湿盒，37℃、30 min;样本上加入BCIP/NBT显色液50 μL湿盒中避光显色5～10 min，甘油封片，光学显微镜下观察拍照。(除加Triton X2100外，余每步后均用0.01 mol/LPBS冲洗，3×5 min)。对照组实验:用不加末端转移酶的作阴性对照;用DNase预先消化的作阳性对照。计算每只大鼠心脏10个切面上心肌梗死区原位末端染色阳性的心肌细胞核的数目。显微镜放大200倍观察单个细胞核，每个切片随机选择6个视野，计算每个视野凋亡细胞核的比例(凋亡细胞核数目/总细胞核数目)以及6个视野凋亡细胞核比例的平均值用于统计学分析。

1.7 大鼠心功能的检查

细胞移植第7天后常规做超声检查，用高频探头，经胸前壁于大鼠胸骨左缘用二维切面超声进行检查，测量左室收缩末期内径(left ventricular endsystolic dimension，LVDs)，舒张末期内径 (left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)，并计算左室长轴缩短率(shortening，FS%)和射血分数(Ejection fraction，EF%)。

1.8 Masson染色检测

移植4周后，长轴中点处垂直于长轴将左心室一分为二，按标准的病理技术行甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，行改良Masson三色染色。

1.9 统计学分析:

2 结果

2.1 MSCs介导的HO-1体内或体外稳定表达

HO-1转染MSCs后体外可观察到强烈的绿色荧光蛋白表达(图1A);HO-1-MSCs中HO-1的表达显著高于Null-MSCs和对照MSCs(图1B，C)。移植7 d后，HO-1-MSCs与宿主心脏心肌细胞汇合(图1D)。hHO-1 mRNA可以在HO-1-MSCs组的心肌组织样本中检测到，而在Null-MSCs和PBS组却检测不到(图1E)。

2.2 HO-1-MSCs移植后对血管再生的影响

图1 MSCs介导的HO-1体内或体外稳定表达Fig 1 HO-1 expression mediated by MSCs in vitro and in vivo(×200)

α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色及毛细血管密度测定表明，相比于Null-MSC和PBS组，HO-1-MSCs移植可以显著增加毛细血管密度;Null-MSCs组毛细血管密度高于PBS组(图2A，B)。ZnPP处理后，毛细血管密度相比MSCs组无统计学差异(图2A，B)。同样地，VEGF和 FGF2在 HO-1-MSCs组的表达也要显著高于Null-MSCs和ZnPP处理过的HO-1-MSCs组，其中，后两者VEGF和FGF2的表达无明显差异(图2C，D)。

2.3 HO-1-MSCs移植后对心肌凋亡的影响:

心肌凋亡实验发现HO-1-MSCs组心肌凋亡显著少于其他组，而 Null-MSCs和ZnPP处理过的HO-1-MSCs组无明显差异。PBS组心肌凋亡数目明显多于Null-MSCs和ZnPP处理过的HO-1-MSCs组(图3)。

2.4 HO-1-MSCs移植后对心室功能及心肌纤维化的影响

移植4周后监测血流动力学参数。相比PBS组，HO-1-MSCs和Null-MSCs组左室功能明显提高(图4A)。图4B是典型的Masson-Trichome染色后的左心室切片图。相比于PBS组，HO-1-MSCs和Null-MSCs组发生心肌纤维化的心肌比例明显减少(图4C，D)。

3 讨论

细胞移植治疗急性心肌梗死会出现移植细胞存活率低的问题。研究显示炎性反应的高峰出现在急性心肌梗死后1周，细胞凋亡是导致供体细胞死亡的主要原因［6］。虽然许多研究关注抗凋亡、抗炎性反应;但血管再生不仅可以提高移植细胞的存活率而且可以减轻心肌凋亡，恢复心脏功能。

图3 HO-1-MSCs移植后对心肌凋亡的影响Fig 3 Effects of HO-1-MSCs transplantation on apoptosis(×200)

图4 HO-1-MSCs移植后对心室功能及心肌纤维化的影响Fig 4 Effects of HO-1-MSCs transplantation on ventricular function and remodeling(×40 100)

MSCs具有分泌促血管再生细胞因子的潜能。然而移植3周后细胞数目明显减少，6周后几乎所有移植细胞都消失［7］。有限存活的MSCs不能达到最大促血管生成的作用。HO-1具有对多种细胞的保护作用;HO-1提高MSCs的生存率，使之发挥最大的生物学行为［8］。最近的研究表明HO-1基因在内皮细胞的过表达使血管再生明显增加［9］。 以腺病毒为载体的HO-1注射到缺血的下肢可以促进下肢血流的明显增加，这种作用部分是因为毛细血管密度增加以及HO-1对血管生成的作用引起［10］。在本研究中，HO-1-MSCs组心肌梗死周边区域毛细血管密度及血管生成因子(VEGF、FGF2)要明显高于Null-MSCs组和ZnPP处理过的HO-1-MSCs组;后两组毛细血管密度及VEGF、FGF2的表达无明显差异，表明 HO-1具有促进血管再生的作用;证明MSCs介导的HO-1也对血管再生具有积极作用。曾有报道NO可能通过上调血管细胞VEGF的分泌来调节血管再生，NO抑制剂可以减少内皮细胞促血管再生作用［11］。CO可能也参与了VEGF的表达［12］。缺血心肌VEGF表达的增加可能是促心肌梗死后心肌血管再生的另一个原因。此外，FGF2也具有促进血管再生，调节血管细胞增殖，迁移和分化的潜能［13］。Lin的研究证明，HO-1基因在心肌梗死后心肌表达可以通过诱导VEGF生成，进一步促进血管再生，对梗死后心肌起到部分的保护作用［14］。

血管再生有利于缺血心肌局部血流的恢复。心肌血供的增强可挽救原本由于心肌缺血丢失或者失去功能的心肌细胞。本研究中，HO-1-MSCs组凋亡细胞相比对照组明显减少，HO-1-1MSCs组左室扩张及纤维化程度均明显减少，心室腔更小，左室前壁室壁更厚。超声心动图进一步证实HO-1修饰的MSCs可以明显提高左室功能。

总之，MSCs介导的HO-1可以促进急性心肌梗死后的血管再生，改善心功能。

志谢:感谢Dr.Lee-young Chau慷慨提供Adv-hHO-1以及对该研究的帮助。

［1］Yaghoubi SS，Campbell DO，Radu CG，et al．Positron emission tomography reporter genes and reporter probes:gene and cell therapy applications［J］．Theranostics，2012，2:374－391．

［2］Li W，Ma N，Ong LL，et al．Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function［J］．Stem Cell，2007，25:2118 －2127．

［3］Tenhunen R，Marver HS，Schmid R．The enzymatic conversion of heme to bilirubin by microsomal heme oxygenase［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1968，61:748－755．

［4］ Liu XM，Peyton KJ，Shebib AR，et al．Activation of AMPK stimulates heme oxygenase-1 gene expression and human endothelial cell survival［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300:H84 －93．

［5］Zeng B，Ren X，Lin G，et al．Paracrine action of HO-1-modified mesenchymal stem cells mediates cardiac protection and functional improvement［J］．Cell Biol Int，2008，32:1256－1264．

［6］Terrovitis JV，Smith RR，Marbán E．Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart［J］．Circ Res，2010，106:479 － 494．

［7］ Deshane J，Chen S，Caballero S，et al．Stromal cell-derived factor 1 promotes angiogenesis via a heme oxygenase 1-dependent mechanism［J］．J Exp Med，2007，204:605－618．

［8］Wu ML，Ho YC，Lin CY，et al．Heme oxygenase-1 in inflammation and cardiovascular disease［J］．Am J Cardiovasc Dis，2011，1:150 －158．

［9］Jazwa A，Loboda A，Golda S，et al．Effect of heme and heme oxygenase-1 on vascular endothelial growth factor synthesis and angiogenic potency of human keratinocytes［J］．Free Radic Biol Med，2006，40:1250－1263．

［10］Jazwa A，Stepniewski J，Zamykal M，et al．Pre-emptive hypoxia-regulated HO-1 gene therapy improves post-ischaemic limb perfusion and tissue regeneration in mice［J］．Cardiovasc Res，2013，97:115 －124．

［11］Dulak J，Józkowicz A，Dembinska-Kiec A，et al．Nitric oxide induces the synthesis of vascular endothelial growth factor by rat vascular smooth muscle cells［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20:659 －666．

［12］Józkowicz A，Huk I，Nigisch A，et al．Heme oxygenase and angiogenic activity of endothelial cells:stimulation by carbon monoxide and inhibition by tin protoporphyrin-IX［J］．Antioxid Redox Signal，2003，5:155 －162．

［13］Lin HH，Chen YH，Chang PF，et al．Heme oxygenase-1 promotes neovascularization in ischemic heart by coinduction of VEGF and SDF-1［J］．J Mol Cell Cardiol，2008，45:44－55．

［14］Narula J，Kolodgie FD，Virmani R．Apoptosis and cardiomyopathy［J］．Curr Opin Cardiol，2000，15:183 －188．