李雪婷，谢勇恩

(川北医学院 免疫与分子生物学研究所， 四川 南充 637007)

MBP-1过表达对食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响

李雪婷，谢勇恩*

(川北医学院 免疫与分子生物学研究所， 四川 南充 637007)

MBP-1又称为c-MYC启动子结合蛋白(c-MYC promoter binding protein)，其过表达可抑制多种癌细胞的增殖，但对食管癌细胞的影响尚未见报道。本研究构建了MBP-1的重组真核表达质粒，并将该重组质粒转染食管癌Eca-109细胞，检测MBP-1能否在食管癌细胞中过表达及其对食管癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 质粒载体和细胞系:pcDNA3.1(+)质粒(本研究所唐恩洁教授赠送)，含MBP-1基因的质粒pCMV6-MBP-1(Origene公司)，食管癌Eca-109细胞系(中国科学院上海细胞生物研究所)。

1.2 主要试剂:PCR试剂盒(成都朝晖生物技术公司)。Lipofectamine2000、DAB 显色试剂盒、MTT、鼠抗MBP-1单克隆抗体、兔抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(晶美公司)，凋亡检测试剂YO-PRO-1(Molecular Probe公司)。其余试剂均为国产或进口分装(分析纯)。

1.3 MBP-1重组真核表达载体的构建:根据GenBank中MBP-1的mRNA序列(GenBank accession number：GU170215)，设计如下引物：P1:5′-GCAAGCTTATGGATGGAACAGAAAATAAAT CTAAG-3′；P2:5′-GCGGATCCACAGCTTACTTGGCCAG-3′。引物P1的5′末端引入HindⅢ的酶切位点，引物P2的5′末端引入BamHⅠ酶切位点。以质粒pCMV6-MBP-1为模板，通过PCR扩增获取MBP-1目的基因，PCR扩增产物与质粒pcDNA3.1(+)的酶切、连接、转化和重组质粒的筛选参照文献[1]进行，对重组质粒进行酶切和DNA测序鉴定。

1.4 Western blot检测:食管癌Eca-109细胞以2×106个细胞/孔接种25 cm2细胞培养瓶，置CO2孵箱培养，当细胞达90%汇合时用于转染，细胞分为3组，每组3瓶细胞，第1组转染重组质粒，第2组转染质粒pcDNA3.1(+)，第3组不做任何处理，细胞转染按脂质体转染试剂Lipofectin2000说明书进行。转染72 h后收集细胞，细胞总蛋白的制备及免疫印迹检测参照文献[2]进行，通过图像分析软件对蛋白印迹条带进行吸光度分析，计算MBP-1印迹条带与β-actin印迹条带的吸光度值之比作为MBP-1的表达量，本实验重复3次。

1.5 细胞增殖检测:采用MTT法，Eca-109细胞以5×103个/孔接种96孔细胞培养板，置CO2孵箱培养，当细胞汇合至70%后进行转染，转染前将细胞分成4组，第1组细胞用重组质粒转染，第2组细胞用空白质粒pcDNA3.1(+)转染，第3组细胞只加入转染剂量的脂质体，第4组细胞不做任何处理作为空白对照，各组均设3个重复孔，于转染后72 h向各孔细胞中加入MTT(50 g/L)20 μL，细胞继续培养4 h后，将细胞培养板放入离心机中以2 000r/min离心10 min，去除细胞培养液，每孔加入100 μL二甲基亚砜充分振荡混匀，于酶标仪上测定其490 nm处的A值，计算细胞增殖抑制率[细胞增殖抑制率=(1-实验孔A值/空白对照空A值) ×100%]，该实验重复3次。

1.6 细胞凋亡检测:Eca-109细胞以2×104个/孔接种24孔板，共接种9孔，当细胞生长达70%汇合后进行细胞转染，转染前将细胞分成3组，每组3孔细胞，第1组加入转染剂量的脂质体，第2组用空白质粒pcDNA3.1(+)进行转染，第3组细胞用重组质粒转染，转染72 h后进行细胞凋亡检测，向每孔细胞中加入凋亡检测试剂YO-PRO-1 至终浓度为0.1 μmol/L，同时加入碘化丙啶(PI)至终浓度为2 mg/L，30 min后，用倒置荧光显微镜观察，计数每200个细胞中凋亡细胞所占的百分比，该实验重复3次。

1.7 统计学分析:使用SPSS13.0统计分析软件，采用方差分析法比较各组细胞相应检测指标的差异(Plt;0.05)。

2 结果

2.1 MBP-1重组真核表达载体的构建:PCR扩增获得了大小约1 kb的DNA片段，将其定向克隆入质粒载体pcDNA3.1(+)后，筛选到分子质量约为6.4 kb的重组质粒，DNA测序结果表明插入片段的核苷酸序列与GenBank中MBP-1的mRNA序列符合率为100%，表明重组质粒构建成功，将其命名为pcDNA3.1(+)/MBP-1。

2.2 Western blot检测结果:免疫印迹杂交检测结果(图1)，其中质粒pcDNA3.1(+)转染细胞和空白对照细胞MBP-1的表达量分别为0.302±0.059和0.334±0.067，二者表达量无明显差异。重组质粒pcDNA3.1(+)/MBP-1转染细胞MBP-1的表达量为0.626±0.073，其表达量显著高于质粒pcDNA3.1(+)转染细胞和空白对照细胞(Plt;0.05)。

1.untreated Eca-109 cells；2.pcDNA3.1(+) transfected Eca-109 cells；3.pcDNA3.1(+)/MBP-1 transfected Eca-109 cells图1 Western-blot检测MBP-1在食管癌细胞Eca-109中的表达Fig 1 Western-blot analysis of MBP-1 expression in esophageal cancer cell Eca-109

2.3 细胞增殖检测结果:转染剂量的脂质体转染细胞和空白质粒转染食管癌细胞的细胞增殖抑制率分别为7.38%±0.81%和9.37%±1.02%，二者间无显著性差异, 而重组质粒pcDNA3.1(+)/MBP-1转染细胞的细胞增殖抑制率为30.03%±4.1%，显著高于脂质体和空白质粒转染细胞(Plt;0.05)。

2.4 细胞凋亡检测结果：荧光显微镜镜检结果(图2)，其中呈现亮绿色荧光的为凋亡细胞。转染剂量的脂质体处理细胞和空白质粒转染细胞在转染后72 h的细胞凋亡率分别为7.97%±1.71% 和8.38%±3.34%，二者之间无显著性差异, 而重组质粒pcDNA3.1(+)/MBP-1转染细胞在转染后72 h的细胞凋亡率为26.49%±2.82%，明显高于脂质体和空白质粒转染细胞(Plt;0.05)。

3 讨论

本研究通过构建MBP-1重组真核表达质粒，人为造成MBP-1在食管癌细胞过表达的基础上，进一步研究了MBP-1过量表达对食管癌细胞增殖及凋亡的影响，结果发现MBP-1过量表达可显著抑制食管癌细胞的增殖并促进食管癌细胞的凋亡。MBP-1的类似作用也在其他肿瘤细胞的研究中得到证实，研究发现体外培养的胃癌细胞转染MBP-1真核表达质粒pcDNA-HA-MBP-1后，可使MBP-1过表达，过表达MBP-1的胃癌细胞其增殖活性明显减弱，癌细胞的侵袭和转移活性也明显受到抑制，而用siRNA沉默胃癌细胞MBP-1表达则使癌细胞的增殖、侵袭和转移活性增强。随后的动物实验发现MBP-1在胃癌细胞的过表达可使其在裸鼠体内的成瘤活性降低[3]。本研究没有采用流式术检测细胞凋亡， 因为贴壁细胞必须用胰蛋白酶消化收集后，才能进行流式细胞学检测，在消化过程中可能导致细胞的损伤和破坏，导致检测结果假阳性高、结果重复性差等缺点。YO-PRO-1是美国Molecular Probe公司专门为检测贴壁细胞凋亡而开发的一种DNA特异性荧光染料, 在细胞凋亡的早期, 细胞膜发生轻微通透性改变时，YO-PRO-1能够进入细胞，并与核内DNA结合发出强烈的绿色荧光，而PI只能透过坏死细胞通透性很强的细胞膜而与DNA结合发出红色荧光，二者联合使用，可将活细胞、凋亡细胞和坏死细胞区分开来，这种方法操作简便，其结果也更加可靠。

A.llipofectin treated cells under the ordinary light；B.llipofectin treated cells under the fluorescent light；C.pcDNA3.1(+) transfected cells under the ordinary light；D.pcDNA3.1(+) transfected cells under the fluorescent light；E.pcDNA3.1(+)/MBP-1 transfected cells under the ordinary light；F.pcDNA3.1(+)/MBP-1 transfected cells under the fluorescent light

图2倒置荧光显微镜下细胞凋亡结果
Fig2Cellapoptosisunderinvertedfluorescentmicroscope(×100)

[1] 卢俊宇，金鹏，高巍, 等. 错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建及鉴定[J]. 基础医学与临床，2012，32：338-341.

[2] 何昀，刘东尧，温晟，等. 小干扰RNA抑制L2RYC细胞MDR1表达及逆转对长春新碱的耐药性[J]. 基础医学与临床，2012，32：1009-1014.

[3] Hsu WK, Hsieh RH, Wu CW,etal. MBP-1 Suppresses growth and metastasis of gastric cancer cells through COX-2[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20：5127-5137.

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2013-01-03

2013-05-02

四川省杰出青年科学基金(08ZQ026-081)

*通信作者(correspondingauthor)： cbyxye0369@163.com

1001-6325(2014)02-0246-03

R 735.1

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