刘西京，南 楠，，侯安国

(1.深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055;2云南中医学院，云南 昆明 650500)

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽之效［1］。药理研究证明板蓝根具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗内毒素、抗肿瘤以及免疫调节等作用［2-3］，临床上主要用于病毒性疾病及细菌感染性疾病的治疗［4］。

关于板蓝根清热解毒的物质基础研究有大量报道，如陈凯等认为总氨基酸和总生物碱是其抗炎的有效部位［5］;何立巍等认为多糖可能为板蓝根的活性成分之一［6］;也有学者认为有机酸是板蓝根的有效成分［7］;徐丽华等发现水提物、总生物碱、表告依春有较强的抗病毒作用［8］;也有学者认为，板蓝根药材中的尿苷、鸟苷、腺苷等核苷类成分是其主要活性成分［9］。

尽管研究众多，但仍缺乏共识。本课题组研究发现板蓝根植物含多肽量较高，又有良好的体内外抗病毒效果。本实验拟模拟胃肠环境研究板蓝根多肽的降解情况，为进一步深入研究板蓝根抗病毒活性成分和药理作用提供实验基础。

1 仪器与试剂

1.1 药品与试剂 板蓝根 (产地甘肃);胃蛋白酶、胰蛋白酶、十二烷基磺酸钠 (SDS)、Bis-Acrylamide、Acrylamide、硫酸铵 (AP)(均为Sigma公司);TEMED(Aldrich公司);SDS-PAGE蛋白标准 (Pharmacia低分子量蛋白标准);4×上样缓冲液 (Fermentas);考马斯亮蓝 R-250(Amresco分装);硝酸银 (成都化学试剂厂);硫酸铵 (岳阳宝庆化工);10 kD超滤离心管 (Millipore);BCA试剂盒(碧云天生物);甲醇、乙腈 (Merck色谱纯);乙醇 (天津市化学试剂分析纯);磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、盐酸、冰乙酸 (均为天津南开化工厂分析纯);DNFB(西亚试剂);Tris(Serva公司)。

1.2 仪器 Multiskan MK3全自动酶标仪 (Thermo公司);Agilent 1100高效液相色谱仪;Eclipse XDB C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);DZKW-D-2电热恒温水浴锅(郑州南北仪器设备有限公司);KY-IA恒温摇床 (金坛市岸头良友实验仪器厂);Avanti J30I大容量冷冻离心机;ALPLTA 1-2冷冻干燥机 (CHRIST公司);Milli-Q超纯水机 (Milipore公司);移液器 (Eppendorf公司);小型垂直电泳系统 (Bio-Rad公司);170-8170凝胶成像分析仪(Bio-rad公司)。

2 方法与结果

2.1 板蓝根总肽的制备 取药材适量，粉碎过二号筛，加10倍量超纯水浸提24 h，10000 r/min离心取上清，加(NH4)2SO4至体积分数为80%，静置过夜，5000 r/min离心取沉淀，冻干得板蓝根总肽，实验时加蒸馏水配制成0.25 g/L多肽溶液。

2.2 板蓝根多肽在人工胃液或人工肠液中的降解研究 取7支1.5 mL离心管，每管加入人工胃液或人工肠液100 μL，37℃水浴恒温，然后分别加入多肽溶液 (37℃预温)100 μL，37 ℃ 消化。分别于 0、1、5、15、30、90、180 min取样，加入0.168 mol/L Na2CO3适量，调节pH使酶解反应终止。离心取上清液，以空白胃肠液作为对照，BCA法检测蛋白浓度［10］;以SDS-PAGE法检测板蓝根多肽的降解情况。

2.2.1 SDS-PAGE法检测板蓝根多肽降解情况 由图1可知，板蓝根多肽主要相对分子质量约为26～100 kD，其中26 kD附近蛋白量最高，34 kD处次之，其他相对分子质量的多肽丰度相对较低，不成条带，36 kD处为胃蛋白酶条带。经人工胃液消化后，0～5 min内消化产物电泳图谱无明显差别，随时间延长，26 kD附近条带明显变浅，34 kD处无明显变化，无新条带产生。

图1 板蓝根多肽经人工胃液降解后的SDSPAGE电泳谱图

经人工肠液消化 (见图2)，24 kD附近的条带为胰蛋白酶的条带，随着时间的变化，34 kD处条带渐渐变浅，26 kD处条带无明显变化。

图2 板蓝根多肽经人工肠液降解后的SDSPAGE电泳谱图

2.2.2 BCA法测定板蓝根多肽在人工胃液和人工肠液中的变化 板蓝根多肽经人工胃液消化后，1 min内板蓝根多肽量下降，而后显著上升，在15 min时达到峰值，其后缓慢下降，到90 min后基本稳定。经人工肠液消化后，1 min内板蓝根多肽量下降，而后缓慢上升，在45 min达到峰值，其后至180 min缓慢下降。见图3。

图3 消化后多肽变化曲线

2.3 HPLC法测定氨基酸 采用2，4-二硝基氟苯 (DNFB)柱前衍生化法测定样品中游离氨基酸［11］。

2.3.1 样品制备 精密称取5 g板蓝根粉末，粉碎过二号筛，加10倍量超纯水浸提24 h，6000 r/min离心15 min，取上清液。置于蒸发皿中挥发至约50 mL，转移至100 mL量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀。以“2.2”项法操作，进样10 μL，即得。

2.3.2 标准曲线 苏氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸线性方程分别为 A=8262C +45.299、A=4629.3C +1306.1、A=604.02C+255.37、A=8703.5C － 4.3392，线性范围分别为0.0117～1.17、0.067～6.7、0.2954～29.54、0.0044 ～0.44 μg。

2.3.3 色谱条件 Agilent ODS C18色谱柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm);流动相A为0.014 mol/L磷酸盐缓冲液 (用磷酸二氢钠调pH 8.2)，流动相B为乙腈水溶液 (V乙腈∶V水=1∶1)，梯度洗脱 (0～20 min，20% ～80%B);体积流量1 mL/min;柱温30℃。检测波长为360 nm(0～8.2 min)，398 nm(8.2～10.0 min)，360 nm(10～20 min);进样量10 μL;步长4 nm。结果见表1。

表1 板蓝根多肽消化前后氨基酸变化情况

由结果可知，除了经人工肠液消化降解后，精氨酸的量有一定程度的增加外，其他游离氨基酸无明显变化。

3 讨论

3.1 根据实验结果可知，板蓝根多肽主要集中在相对分子质量约为26～100 kD之间，尤其是以26 kD和34 kD附近为主。经人工胃液消化后，随着时间的推移，26 kD附近条带明显变浅，34 kD附近条带基本无明显变化。与此相反，经人工肠液消化后，随着时间的推移，34 kD附近条带明显变浅，26 kD附近条带基本无明显变化，说明经过胃肠液作用后，板蓝根多肽被降解破坏。

为了测定的准确性，故选板蓝根中主要的苏氨酸、脯氨酸、精氨酸和缬氨酸进行测定。HPLC测定结果表明，经过人工胃肠液消化后，除精氨酸的量有少量增加外，其余氨基酸无明显变化;BCA法测定结果表明，经消化后胃肠液中仍有大量多肽。

以上结果综合可知，经过人工胃肠液消化后，板蓝根多肽有了降解变化，但氨基酸的变化不明显，说明板蓝根多肽降解成了小分子多肽，而没有进一步分解成游离氨基酸，BCA法测定结果也证实了这一结果。

3.2 最初测定总肽消化前后氨基酸的变化情况时，由于氨基酸含有量极低，不容易测定，因此，用水提液进行消化测定，提高了测定的准确度。

3.3 传统认为蛋白或高分子多肽只有被水解为氨基酸后才能被人体或动物吸收，后来发现蛋白质在消化道的降解产物大部分是小分子多肽，他们以完整形式被吸收进入循环系统而被组织利用，与游离氨基酸相比，小肽吸收具有吸收快、耗能低、吸收率高等优势。对于板蓝根的物质基础到底为何众多学者进行了有益的探索，本课题组研究板蓝根的水提醇沉液时，经阳离子树脂后氨洗得到多肽部分，占水提醇沉后固体量一半左右。经过初步药理实验表明板蓝根多肽具有一定抗流感病毒的作用，认为板蓝根有效部位为多肽，与报道［12］相符。本实验结果也证明，板蓝根多肽在体内主要降解成小分子肽被吸收，在《中国药典》2010年版中，把氨基酸作为定性鉴别也值得商榷。由于多肽活性的多样性，有必要对植物多肽研究引起足够的重视，而不是传统的当做杂质而除去。

［1］孙东东，何立巍，陈建伟，等.基于多指标综合检测优选板蓝根提取工艺［J］.北京中医药大学学报，2013，36(3):183-187.

［2］倪 华，施 霞，刘云海.板蓝根化学成分及其药理活性研究进展［J］.齐齐哈尔医学院学报，2008，29(13):1609-1611.

［3］王 蓓.板蓝根的基础研究及临床应用［J］.广西民族大学学报:自然科学版，2006(z2):119-120.

［4］李 进，王 盛，李 祥，等.超滤技术分离纯化板蓝根有效成分的工艺研究［J］.中成药，2013，35(3):622-624.

［5］陈 凯，窦 月，孟凡刚，等.板蓝根抗炎作用有效部位初步筛选［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(6):200-203.

［6］何立巍，李 祥，王洪兰，等.板蓝根多糖的结构特征及活性研究［J］.中国药房，2011，36(16):2179-2182.

［7］汤 杰，万 进，马永贵，等.大孔吸附树脂分离纯化板蓝根有机酸组分［J］.中国医院药学杂志，2011，31(18):1504-1507.

［8］徐丽华，黄 芳，陈 婷，等.板蓝根中的抗病毒活性成分［J］.中国天然药物，2005，3(6):359-360.

［9］肖 慧，刘清飞，王义明，等.正交试验优化提取板蓝根药材中核苷类成分的研究［J］.中国新药杂志，2009，18(4):353-355.

［10］曹玉华.BCA法测神奇灵颗粒剂中蛋白含量［J］.中国实用医药，2009，4(7):43-44.

［11］万绍晖，徐 玫，王 荔，等.反相高效液相色谱-柱前衍生化法测定复方板蓝根颗粒中氨基酸的含量［J］.中药材，2005，28(7):594-595.

［12］孙秀霞，张丽莉，孙翠兰.板兰根抗病毒有效部位研究［J］.中国药理学通报，2007，23(6):825-836.