刘江华，戴碧涛，张 妮，梁绍燕，于 洁

(重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤科，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地，重庆 400014)

芹菜素 (化学名4'，5，7-三羟基黄酮)是一种多酚类黄酮化合物，广泛分布于芹菜、洋葱、橘子等多种水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等药理活性，其中以抗肿瘤作用最为突出［1-2］。实验证明，芹菜素对多种肿瘤细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用，如肺癌NCI-H460细胞［3］、胃癌 SGC-7901 细胞［4］、卵巢癌 CAOV3 细胞［5］、膀胱癌BIU-87细胞［6］等。对白血病的研究发现，芹菜素在体外能诱导急性早幼粒白血病细胞株HL-60发生凋亡［7］，在体内能够抑制小鼠移植性白血病肿瘤的生长［8］，但其抗白血病作用的机制尚不明确。

SALL4是新发现的癌基因，位于20q13，编码一种锌指蛋白转录因子，其异常表达与白血病的发生及预后密切相关。SALL4过表达的转基因小鼠最终发生了急性髓细胞白血病，且在不同类型的白血病细胞株及病人中都检测到了SALL4的高表达;SALL4致白血病的机制可能是通过激活造血干细胞自我更新的重要通路 Wnt/β-catenin通路实现的［9-10］。

芹菜素作为潜在的抗肿瘤药物，对SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路的影响目前未见报道。本研究选择急性单核细胞白血病细胞株U937作为研究对象，探讨芹菜素对U937细胞增殖凋亡及SALL4基因和Wnt/β-catenin信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 芹菜素 (纯度＞95%)、二甲基亚砜 (DMSO)购自Sigma公司;RPMI-1640培养基、胎牛血清 (FBS)购自Hyclone公司;CCK-8试剂购自南京凯基生物科技发展有限公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司;TRIzol试剂购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒及SYBR GreenⅡ荧光染料购自Takara(大连宝生物生物工程有限公司);SALL4多抗购自 GeneTex公司，Bcl-2、Caspase-3单抗购自Cell Signaling公司，β-actin单抗及羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物有限公司。实验前将芹菜素溶解在DMSO溶剂中，配成39.2 mmol/L的浓缩液，－20℃贮存备用。实验时用含10%FBS的RPMI-1640培养基配制成芹菜素工作液，DMSO终质量分数在0.4%以下，预实验证明该质量分数对细胞生长无影响。

1.2 方法

1.2.1 细胞株及细胞培养 人U937细胞株由重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所传代冻存。复苏后培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的 RPMI-1640培养液中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 倒置显微镜观察细胞形态变化 取对数生长期的U937细胞，加入不同体积的芹菜素浓缩液，使芹菜素终浓度分别为0、20、40、60 μmol/L(0组为对照组)。培养24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.3 CCK-8法检测芹菜素对U937细胞的增殖影响 将不同处理组细胞 (芹菜素终浓度分别为0、20、40、60 μmol/L)以1×105个/mL密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL培养体系，每组设3个复孔。置37℃、5%CO2的培养箱分别培养12、24、36 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中继续孵育2 h，酶标仪上测定450 nm波长处每孔细胞的光密度值 (A)。按以下公式计算细胞增殖抑制率 (%)=［(对照孔A值－加药孔A值)/对照孔A值］×100%，并计算API处理U937细胞24 h的IC50。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪测定细胞周期 收集不同浓度(0、20、40、60 μmol/L)芹菜素处理 24 h 的U937细胞，800 r/min离心5 min，弃上清，预冷PBS洗涤细胞2次，75%乙醇固定细胞。离心重悬细胞后加入碘化丙啶，4℃避光孵育1 h后上流式细胞仪检测。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 收集不同浓度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素处理24 h后的细胞，800 r/min离心5 min，弃上清，预冷PBS洗涤细胞2次。Binding Buffer重悬细胞后，取195 μL的细胞悬液加入5 μL的Annexin V-FITC，混匀后间隔3 min，再加入10 μL碘化丙啶，室温避光孵育10 min后上流式细胞仪检测。

1.2.6 引物设计及合成 根据GeneBank中人SALL4(NM_020436.3)、C-Myc(NM_002467.4)、CCND1(NM_053056.2)、β-actin(NM_001101.3)基因序列设计引物，引物序列见表1。引物均由上海英骏生物工程有限公司合成。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of real-time PCR primers

1.2.7 荧光定量PCR检测基因表达水平 收集不同浓度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素处理36 h的细胞，按TRIzol试剂的操作说明提取总RNA，分光光度计测定 RNA浓度及纯度，A260/A280为1.8～2.1者用于逆转录反应。逆转录条件为:37℃ 15 min，85℃ 5 s。以合成的cDNA为模板，进行荧光定量PCR反应，条件为:95℃预变性30 s，95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40个循环，65℃ ～95℃记录熔解曲线。在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪器上进行反应，以SYBR GreenⅡ作为荧光染料，记录样本的循环阈值 (Ct值)。目的基因Ct值减去内参基因Ct值用ΔCt表示，处理组ΔCt值减去对照组 ΔCt值用ΔΔCt表示，以2－ΔΔCt相对定量法计算各处理组相对于对照组基因表达水平的变化。

1.2.8 Western Blot检测蛋白表达水平 收集不同浓度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素处理36 h的细胞，用蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白，取50 μg蛋白经10%SDS-PAGE电泳后转移至 PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2 h，加一抗4℃孵育过夜，一抗稀释度为SALL4(1∶800)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、β-actin(1∶200)。TBST洗膜3次，加1∶1000稀释的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室温孵育1 h后，TBST洗膜，加入ECL发光成像。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示。两样本均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芹菜素处理后U937细胞形态的变化 与对照组相比，随着药物浓度的增高，处理组的细胞密度逐渐降低，细胞内颗粒增多，透明度逐渐下降，细胞碎片增多。其中60 μmol/L处理组可见大量细胞碎片，活细胞少见 (图1)。

图1 不同浓度芹菜素处理U937细胞24 h后细胞形态的变化 (200×)Fig.1 Morphological changes of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(200×)

2.2 芹菜素对U937细胞增殖的影响 与对照组相比，处理组的细胞增殖明显受抑制 (P＜0.01，表2)。同一时间点随着药物浓度的升高，细胞增殖抑制率逐渐增高 (P＜0.05);同一药物浓度，随着作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐增高(P＜0.05)。说明芹菜素对U937的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性。24h的 IC50=32.18 μmol/L，36 h 的 IC50=22.37 μmol/L。

表2 芹菜素对U937细胞增殖抑制率的影响 (%，，n=3)Tab.2 Inhibition rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

表2 芹菜素对U937细胞增殖抑制率的影响 (%，，n=3)Tab.2 Inhibition rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

注:与对照组比较，＊＊P＜0.01

芹菜素/(μmol·L －1)12 h 24 h 36 h 000020 20.54 ±4.13＊＊ 36.74 ±2.57＊＊ 46.70 ±1.46＊＊40 32.04 ±2.96＊＊ 56.70 ±3.92＊＊ 66.82 ±1.77＊＊60 41.42±3.02＊＊ 66.35±3.34＊＊ 77.86±1.30＊＊

2.3 芹菜素对U937细胞周期的影响 与对照组相比，随着药物浓度的升高，G2/M期细胞比例增多 (P＜0.01)，S期细胞比例下降，但差异无统计学意义 (P＞0.05)(表3，图2)。提示芹菜素对细胞周期的阻滞发生在G2/M期，且在一定范围内，与药物剂量正相关 (P＜0.01)。

表3 芹菜素作用24 h后U937细胞的周期分布 (%，，n=3)Tab.3 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

表3 芹菜素作用24 h后U937细胞的周期分布 (%，，n=3)Tab.3 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

注:与对照组相比，*P＜0.05

芹菜素/(μmol·L －1)G0/G1 S G2/M 060.49±6.70 38.91±6.28 0.60±0.4520 53.29±0.58 35.19±1.85 11.52±2.20*40 52.15±2.46 30.56±1.83 18.43±1.14*60 39.87±5.41 27.31±5.59 29.34±0.68*

图2 芹菜素作用24 h后U937细胞的周期分布Fig.2 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h

2.4 芹菜素对U937细胞凋亡的影响 与对照组相比，随着药物浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增高(P＜0.05)，并在一定范围内有浓度依赖性 (P＜0.05，表4，图3)。

表4 不同浓度芹菜素作用24 h对U937细胞凋亡率的影响(%，，n=3)Tab.4 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(%，，n=3)

表4 不同浓度芹菜素作用24 h对U937细胞凋亡率的影响(%，，n=3)Tab.4 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(%，，n=3)

注:与对照组相比，*P＜0.05

芹菜素/(μmol·L－1) 凋亡率/%3.42±1.1320 5.66±0.60*40 7.90±0.26*60 10.86±0.940*

2.5 芹菜素对SALL4及Wnt/β-catenin通路下游靶基因c-Myc、CCND1表达的影响 随着芹菜素浓度的升高，SALL4、c-Myc、CCND1的表达量逐渐下降。与对照组相比，差异有统计学意义 (P＜0.05，表5，图4)。经Pearson相关性分析，SALL4与c-Myc、CCND1表达量正相关，相关系数分别为0.882和0.662，差异有统计学意义 (P＜0.05)。

表5 Real-time PCR检测芹菜素作用36 h后SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相对表达量 (，n=3)Tab.5 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA by real-time PCR(，n=3)

表5 Real-time PCR检测芹菜素作用36 h后SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相对表达量 (，n=3)Tab.5 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA by real-time PCR(，n=3)

注:与对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

芹菜素/(μmol·L －1)2 － ΔΔ Ct SALL4 C-MYC CCND101.00±0.12 1.00±0.04 1.00±0.0820 0.76±0.06* 0.71±0.04* 0.51±0.13＊＊40 0.53 ±0.06＊＊ 0.48 ±0.04* 0.36 ±0.05＊＊60 0.37±0.08＊＊ 0.24±0.09* 0.35±0.09＊＊

2.6 芹菜素对SALL4、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 芹菜素处理U937细胞36 h后，SALL4、Bcl-2蛋白表达水平降低，Caspase-3表达升高，与对照组相比，差异有统计学意义 (P＜0.05)(图5)。

图3 芹菜素作用24 h后U937细胞的凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h

图4 real-time PCR检测各组细胞SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相对表达量Fig.4 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA in various groups by realtime PCR

3 讨论

化疗是儿童急性白血病和其他恶性肿瘤的主要治疗手段，大剂量化疗可以产生更强的肿瘤细胞凋亡作用;然而化疗药物的毒副作用及耐药问题严重困扰着临床治疗。芹菜素作为一种天然植物成分，因其高效、低毒、无诱变性等特点，逐渐成为新兴的研究热点。本实验结果显示，20、40、60 μmol/L的芹菜素都表现出抑制U937细胞增殖的能力，且随着药物浓度的升高和时间的延长，抑制作用逐渐增强，呈现出明显的时间和剂量依赖性。本研究还发现芹菜素能够通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3诱导细胞凋亡，印证了Budhraja的研究结果［8］。细胞增殖和凋亡的动态平衡是维持机体正常状态的重要条件，肿瘤的形成就是由于恶性细胞增殖加快、凋亡受阻，打破了这种动态平衡所致。本研究的结果提示芹菜素能够通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，恢复正常的生理平衡，从而起到抗肿瘤的作用。

图5 芹菜素处理后各组细胞SALL4、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达水平Fig.5 Protein expression levels of SALL4，Bcl-2 and Caspase-3 in U937 cells in various groups after apigenin treatment

细胞周期是一个复杂有序的生理过程，对维持机体正常功能具有重要作用，许多化疗药物就是通过作用于特定的细胞周期发挥作用的，如阿糖胞苷主要作用于S期，长春新碱特异地作用于M期。在细胞周期的调控过程中，从G0期能否进入S期、从G2期能否进入M期是两个关键点。若能阻断细胞从某一时相进入下一时相，导致细胞蓄积在特定时相，此时再给予该时相特异性药物就能够增强对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究通过流式细胞术检测芹菜素对U937细胞周期的影响，发现不同浓度的芹菜素处理细胞后，引起G2/M期的细胞增多，说明芹菜素对细胞周期的阻滞作用发生在G2/M期，与文献报道一致［11-12］。推测如果把芹菜素与G2/M期特异性化疗药物联合应用，既可以增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤性，增加化疗药物的敏感性，又可以减少化疗药物的用量，降低药物的毒副作用。

SALL4是果蝇Spalt的同源基因，在维持胚胎干细胞的多能性及自我更新中起着重要作用，其突变可导致畸形的发生，如Okihiro综合征和IVIC综合征［13-15］。在正常造血发育中，SALL4主要表达于CD34

+的造血干/祖细胞，随着细胞的分化成熟，其表达量逐渐降低，在成熟造血细胞中几乎不表达，而在白血病细胞中表达升高［10］，提示SALL4可能参与了白血病的发生。有研究认为SALL4可能通过与β-catenin结合，激活白血病自我更新的重要通路 Wnt/β-catenin 信号通路［9］。c-Myc和 CCND1是Wnt通路中重要的下游靶基因。c-Myc是早期发现的原癌基因，控制细胞的增殖和分化，与肿瘤的发生密切相关。CCND1编码的CYCLIN-D1是细胞周期调节的重要因子，过表达可以促进细胞增殖。通过RNA干扰技术抑制SALL4的表达后发现，β-catenin 和 c-Myc、CCND1 的表达随之下调［11］，提示阻断SALL4可以抑制Wnt信号通路的传导，从而可能抑制肿瘤的发生。关于芹菜素对SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路的作用，此前尚未见报道。本研究通过荧光定量PCR及Western blot等技术检测了芹菜素对SALL4及Wnt通路下游因子c-Myc、CCND1表达的影响，发现芹菜素能下调SALL4、c-Myc、CCND1的表达，且 SALL4与 c-Myc、CCND1有明显相关性，提示芹菜素可能通过抑制SALL4表达，阻断Wnt/β-catenin信号通路发挥其抗白血病作用。

综上所述，芹菜素对U937细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用。其机制可能与抑制SALL4基因的表达，阻断Wnt/β-catenin信号通路，调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3的表达有关。

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