万慧芳，余 波，涂 硕，余乐涵，万福生(南昌大学医学院，江西南昌 330006)

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在世 界上被列为第三大恶性肿瘤。在我国，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变、环境污染的加重，结直肠癌的发病率与死亡率均有呈逐年上升趋势。中药在肿瘤的治疗方面有其独特的疗效，且副作用小，深受广大肿瘤患者的好评。川芎嗪 (tetramethylpyraxine)是活血化瘀中药川芎中的一种生物碱，具有扩张血管、抗氧化及改善微循环等药理作用，在临床上的应用范围较广［1-3］。近年研究发现［4-9］，川芎嗪具有抗肿瘤，抑制肿瘤转移及提高药物敏感性等作用，但其作用机制尚未阐明。p53正向凋亡调节因子 (p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)在药物诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用，它是否参与川芎嗪抗结肠癌的作用尚未见报道。本实验旨在观察川芎嗪对人结肠癌LoVo细胞增殖与凋亡的影响及其初步机制。

1 材料和方法

1.1 试剂和抗体 人结肠癌细胞LoVo(p53+/+)和正常人胚肾细胞293T均购自中国科学院细胞库。川芎嗪注射液为山东潍坊制药有限公司 (批号120514)产品，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Dulbecco)培养基以及胎牛血清均购于GIBCO公司，cDNA逆转录试剂盒购于Fermentas公司，GAPDH多抗 (TA-08)、Bcl-2单抗 (sc-783)和Bax单抗 (sc-526)均购于Santa Cruz公司，p53正向凋亡调节因子 (PUMA)多抗 (#Q9 BXH1)购于Cell Signaling Technology公司，辣根酶标记山羊抗鼠 IgG(ZDR-5307)和辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZDR-5306)购于北京中杉金桥公司。

1.2 细胞及药物处理 LoVo细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%CO2条件下培养。依据本研究室以前的实验结果［1-3］，本研究采用0.25～4.0 mg/mL梯度的川芎嗪分别作用24 h、48 h和72 h处理LoVo细胞。又依据MTT结果(作用24 h、48 h及72 h的结果未见显著性差异，故后续实验仅选择作用48 h)，选用1.0、2.0、4.0 mg/mL质量浓度的川芎嗪分别作用LoVo细胞48 h，并观察川芎嗪对细胞凋亡率、PUMA、Bax、及Bcl-2基因表达的影响。

1.3 MTT比色法检测细胞存活率 将对数期生长的细胞接种在96孔板内，使细胞密度至5000～8000个/孔，每组设3个重复孔。次日，加入不同质量浓度川芎嗪药物，川芎嗪组质量浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，作用时间分别24、48、72 h，对照组加等体积培养基。然后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h后终止。用150 μL DMSO充分溶解结晶。酶标仪上在490 nm波长处检测各孔的OD值，并计算抑制率。

1.4 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率 收集对照组及经药物处理48 h后的各组细胞，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞。然后，加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后再加5 μL Propidium Iodide，混匀。室温避光反应5～15 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 RT-PCR检测肿瘤细胞PUMA及Bax、Bcl-2 mRNA的表达 按照Invitrogen/TRIzol试剂盒说明进行操作，先提取总RNA，并按Fermentas试剂盒说明制备 cDNA，然后进行 PCR扩增，最后用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。用凝胶成像系统拍照，Launch SensiAnsys凝胶分析系统软件分析，以GAPDH条带为参照，计算并比较各组目的基因的相对表达量。

1.6 Western blot检测PUMA及Bax、Bcl-2蛋白的表达 收集细胞和提取蛋白，沸水浴使之变性，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDSPAGE)电泳，每孔加样量总蛋白量为30 μg。随后用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。然后将膜与 PUMA，Bax，Bcl-2(1∶200)抗体反应，4℃过夜后，加入辣根过氧化物酶连接的二抗 (1∶2000)反应约1.5 h，最后在暗室内进行检测。用Image-Pro Plus 6.0凝胶图像分析软件对蛋白条带进行灰度值扫描，以GAPDH为对照进行半定量分析。

2 结果

2.1 川芎嗪对结肠癌LoVo细胞的增殖的影响 用0.25～4.0 mg/mL梯度的川芎嗪处理LoVo细胞，观察了川芎嗪对LoVo细胞增殖的影响。结果显示，随着川芎嗪质量浓度和作用时间的增加，川芎嗪对LoVo细胞的增殖抑制作用也逐渐加强 (见表1)。在川芎嗪为1.0、2.0、4.0 mg/mL 3个质量浓度点上作用24 h、48 h及48 h的结果与正常对照组比较均有统计学意义 (P＜0.05)，而各质量浓度川芎嗪对正常293T细胞的生长并没有显著性影响 (见表2)。

表1 川芎嗪对人结肠癌LoVo细胞增殖的影响 (，n=3)Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human colon cancer LoVo cells(，n=3)

表1 川芎嗪对人结肠癌LoVo细胞增殖的影响 (，n=3)Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human colon cancer LoVo cells(，n=3)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

24 h 48 h 72 h川芎嗪0 mg/mL组组别 OD 1.43±0.05 1.51±0.05 1.63±0.05川芎嗪0.25 mg/mL组 1.38±0.05 1.49±0.04 1.59±0.05川芎嗪0.5 mg/mL组 1.34±0.05 1.46±0.04 1.57±0.05川芎嗪1.0 mg/mL组 1.29±0.05*1.42±0.04* 1.47±0.04*川芎嗪2.0 mg/mL组 1.28±0.04*1.37±0.05* 1.43±0.06*川芎嗪 4.0 mg/mL组 1.25±0.04＊＊0.96±0.05＊＊1.19±0.04＊＊

表2 川芎嗪对人正常293T细胞增殖的影响 (，n=3)Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human 293T cells(，n=3)

表2 川芎嗪对人正常293T细胞增殖的影响 (，n=3)Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human 293T cells(，n=3)

注:与对照组比较，*P＜0.05

24 h 48 h 72 h川芎嗪0 mg/mL组组别 OD 1.42±0.06 1.47±0.04 1.50±0.056川芎嗪0.25 mg/mL组 1.41±0.06 1.45±0.04 1.49±0.063川芎嗪0.5 mg/mL组 1.41±0.06 1.46±0.06 1.46±0.042川芎嗪1.0 mg/mL组 1.41±0.05 1.45±0.08 1.47±0.021川芎嗪2.0 mg/mL组 1.38±0.07 1.39±0.07 1.45±0.052川芎嗪4.0 mg/mL组 1.28±0.05*1.43±0.07 1.46±0.018*

2.2 川芎嗪对结肠癌LoVo细胞凋亡的影响 用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果发现 (图1)，与对照组 (凋亡率9.98%)比较，用1.0、2.0、4.0 mg/mL 3个不同质量浓度的川芎嗪处理LoVo细胞48 h后，其细胞凋亡率分别为32.32%、41.51%和49.94%，提示川芎嗪处理组细胞凋亡率呈剂量依赖性增加 (P＜0.01)。

图1 川芎嗪诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡Fig.1 Tetramethylpyrazine induces apoptosis in human colon cancer LoVo cells

2.3 川芎嗪对LoVo细胞中PUMA/Bax/Bcl-2 mRNA表达的影响 由图2(RT-PCR检测)结果表明，随着川芎嗪质量浓度的增加，LoVo细胞的PUMA mRNA表达出现明显上调，促凋亡基因Bax mRNA表达也出现上调，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达则呈现下调，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。

图2 人结肠癌LoVo细胞中PUMA/Bax/Bcl-2的mRNA表达变化Fig.2 Changes of the expresion levels of PUMA/Bax/Bcl-2 mRNAs in human colon cancer LoVo cells

2.4 LoVo细胞中PUMA/Bax/Bcl-2蛋白表达水平 图3的Western Blot结果显示:随着川芎嗪质量浓度的增加，人结肠癌LoVo细胞中PUMA蛋白表达呈明显上调，促凋亡蛋白Bax蛋白表达也明显上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达却出现明显的下调，与对照组相比均有显著性差异 (P＜0.05或P ＜0.01)。

3 讨论

结直肠癌通常由良性腺瘤逐步缓慢演变为恶性腺癌甚至远处转移，因此，筛查与早期诊断是防治结直肠癌的最佳手段。据流行病学资料显示，我国已进入结肠癌高发区的行列。因此，我国对结肠癌防治研究的形势紧迫，探讨结直肠癌的发生发展机制，特别是从基因和人们的生活习惯两个方面研究结直肠癌的发生的分子机制，对结直肠癌的防治将具有十分重要的理论和现实意义。

图3 人结肠癌LoVo细胞中PUMA/Bax/Bcl-2蛋白的表达变化Fig.3 Changes of the expresion levels of PUMA/Bax/Bcl-2 proteins in human colon cancer LoVo cells

近年来报道川芎嗪具有抑制白血病［10］、乳腺癌［11］、宫颈癌［12］、前列腺癌［4］等多种恶性肿瘤的作用，川芎嗪的抗肿瘤作用日益受到人们重视，但它对结直肠癌的防治作用鲜见报道。在本实验中观察到不同质量浓度的盐酸川芎嗪能有效地抑制Lo-Vo细胞增殖，增加其凋亡，且作用具有明显时间和剂量依赖性。本实验从细胞凋亡方向探讨了川芎嗪的抗结直肠癌作用。结果证实:川芎嗪可以抑制人结肠癌LoVo细胞增殖，并可促进结肠癌LoVo细胞凋亡。以 PUMA、Bax、Bcl-2蛋白表达为代表，从线粒体凋亡途径探讨了川芎嗪诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的分子机制，结果提示川芎嗪可通过上调PUMA蛋白表达，进而上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白表达，激活Caspase-3，促进肿瘤细胞凋亡，为川芎嗪用于防治人结肠癌提供了新的分子基础和实验依据。

关于川芎嗪抗肿瘤作用的分子机制，目前各种报道不一。有研究认为川芎嗪能下调VEGF的表达，进而抑制肿瘤的生长转移［13］;也有人认为川芎嗪能降低肿瘤细胞DNA的合成，从而抑制细胞有丝分裂［14］，增强促凋亡基因的表达、抑制某些抗凋亡基因的表达。近期有研究发现AKT及其下游信号通路介导了川芎嗪抑制前列腺癌PC3细胞的增殖与促凋亡作用［4］，即川芎嗪可通过抑制AKT蛋白表达及活性，继而抑制细胞增殖，启动细胞凋亡，最终达到抑制前列腺癌PC3细胞生长的目标。

在中药日益受到人们青睐的今天，已发现许多中药有较好的抗肿瘤作用，其促凋亡的作用还与PUMA的表达密切相关［15］。本实验结果证实，川芎嗪可通过上调PUMA蛋白表达，促进细胞凋亡。Wang等［15］用绿茶多酚处理肠癌细胞LoVo后，发现了同样的作用。类似的报道还有大蒜素诱导肠癌LoVo细胞凋亡时PUMA表达增加，抑制PUMA表达，则大蒜素诱导细胞凋亡的作用明显下降。次黄芩素作用于前列腺癌细胞LNCaP后，其胞内PUMA蛋白表达也增加，细胞色素C从线粒体内释放增多，Caspases级联反应被激活［16］。

Bcl-2蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。在线粒体膜上，Bcl-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用，调控线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡“主开关”的作用，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等，Bax蛋白在正常细胞中存在于细胞质中，当受到死亡信号刺激后，促凋亡蛋白产生增多，Bax与BID或BIM相互作用后形成插入线粒体膜的蛋白孔道，导致线粒体内细胞色素C释放至胞质，在ATP或dATP作用下，与凋亡水解蛋白酶激活因子Apaf-1及胱天蛋白酶-9共同组成凋亡体，诱发细胞凋亡［17］。因此，Bcl-2家族促抗凋亡蛋白的平衡决定了细胞是否凋亡的命运，通过调节抗凋亡与促凋亡蛋白的平衡，调节细胞的存活。

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