庞晓斌，谢欣梅，，王保全，李晓婷

(1.河南大学药物研究所，河南开封 475004;2.河南大学淮河临床医学院，河南开封 475001;3.河南大学药学院，河南开封 475004)

血脑屏障 (blood-brain barrier)位于血液与中枢神经系统 (centralnervoussystem，CNS)的神经组织之间，主要由脑微血管内皮细胞 (Brainvaseularendothelialeell，BVEC)、星形胶质细胞、周细胞、基底膜构成。血脑屏障的破坏可导致血管源性脑水肿，是脑缺血再灌注损伤后脑水肿的重要病理基础［1-2］。

脉络宁注射液源自著名医方“四妙勇安汤”，由玄参、牛膝、石斛、金银花等组成，化学成分包括香豆素类、苯丙素类、昆虫变态激素、三萜皂苷等［3］，具有养阴清热、活血化瘀的功效［4］。临床上广泛用于治疗缺血性脑血管病［5］，疗效可靠，副作用小。有研究表明脉络宁注射液能明显缩小大脑中动脉阻断 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)后引起的脑梗死范围，降低毛细血管通透性，减轻脑水肿等作用，但目前作用机制尚不明确［6-7］。

本实验采用MCAO栓线法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注 (ischemia/reperfusion，I/R)模型，通过观察脉络宁注射液对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障通透性及紧密连接相关蛋白紧密连接蛋白-1(zonular occludens protein-1，ZO-1)、闭合蛋白(occludin)表达的影响，探讨其对血脑屏障的保护作用及其机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，体质量280～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXY(京)2010-0009。实验过程中大鼠的饲养环境稳定，室温 (25±2)℃，相对湿度 (55±5)%，灯光控制12 h昼夜交替。对实验动物的所有操作均符合中国实验动物伦理学的要求。

1.2 药物 脉络宁注射液 (金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，批号20120654);依达拉奉注射液 (国药集团国瑞药业有限公司，批号201110302)

1.3 试剂 氯化-2，3，5-三苯基四氮唑 (2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，伊文思蓝 (Evans Blue，EB)购自Sigma公司;兔抗鼠ZO-1抗体、兔抗鼠occludin抗体购自Santa-Cruz公司;辣根过氧化物酶 (HRP)标记的羊抗兔IgG抗体购自美国Pierce Biotechnology公司;SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色剂购于武汉博士德生物技术研究所。

1.4 主要仪器 显微镜SZX16型(日本Olympus公司);冰冻切片机 (莱卡，德国);PowerGen 125型组织匀浆机 (赛默飞世尔公司);GS-15R离心机 (Beckinan公司，美国)。

2 方法

2.1 动物分组及处理 72只成年健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、缺血再灌注模型组、伊达拉奉给药组 (3 mg/kg)、脉络宁高、中、低剂量组 (4、2、1 mL/kg)，每组12只。各组分别于再灌注即刻由尾静脉注射给药，假手术组与模型组分别给予2 mL生理盐水。

2.2 大脑MCAO法建立大鼠脑缺血再灌注 (I/R)模型 SD大鼠术前12 h禁食，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定。参照Longa等的大脑中动脉线栓法，造成右侧大脑中动脉阻塞［8］。缺血2 h后，将栓线向外拉出至颈内实现再灌注。按照Longa等评分标准，各组分别在再灌注24 h进行评分:0分，正常，无神经学征象;1分，动物不能完全伸展右前肢;2分，动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象;3分，动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚;4分，无自发活动，有意识障碍。神经功能评分在1～3分为模型成功。0分和4分为模型不成功予剔除，在后续实验中补充剔除出组的动物，保证每组动物数。假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓。

2.3 脑梗死体积的测定 各组取再灌注24 h后的大鼠3只，以10%水合氯醛(350 mg/kg体质量)行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经心脏灌流生理盐水固定。断头取脑，迅速将取出的脑组织置于－20℃冰箱，10 min后置室温环境，将脑从额极至枕叶连续冠状切面，厚约2 mm，共5层。然后迅速将脑片置于5 mL含2%TTC的溶液中，37℃恒温、避光孵育30 min，然后置于4%多聚甲醛溶液，4℃固定，数码相机拍照，应用图像分析系统软件处理计算脑梗死体积。经TTC染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。

2.4 血脑屏障通透性检测 各组取大鼠3只，手术后 (给药后)即刻由尾静脉注射2%伊文思蓝(EB)2 mL。再灌注24 h后，快速打开胸腔并暴露心脏，从左心室灌注生理盐水直至流出无色液体，断头取脑，小心剥取右侧大脑半球，电子天平精确称量其湿质量后，加入甲酰胺，于45℃的水浴箱孵育24 h，3000 r/min离心15 min，取上清液，于620 nm处测定吸光度。根据EB溶液标准曲线，计算EB的水平 (μg/g脑质量)。

2.5 Western blot检测ZO-1、occludin的表达 动物于再灌注24 h后，4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，冠状切取前囱前1.0 mm至前囱后3.0 mm的脑组织，进行匀浆;在冰上加蛋白裂解液裂解，然后在4℃下12000 r/min离心5 min，进行蛋白水平的测定;SDS-PAGE电泳，转膜;ZO-1(1∶500稀释)、occludin(1∶500稀释)，4℃孵育过夜;相应二抗室温孵育2 h;ECL发光，曝光，显影，对胶片进行扫描与拍照，采用图像分析系统进行显影条带灰度值分析。

2.6 统计学方法 实验数据用SPSS 11.5统计软件分析，所得结果以表示，组间均数的比较采用t检验，两组以上均数的比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 脉络宁对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响 结果显示，脑缺血2 h再灌注24 h后，假手术组无脑梗死出现，模型组的脑梗死明显;与模型组相比，脉络宁各剂量组脑梗死体积缩小明显，差异显著 (P＜0.05)。见图1。

图1 脉络宁对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响 (，n=3)Fig.1 Effects of Mailuoning on brain infarct volume in I/R rats(，n=3)

3.2 脉络宁对大鼠缺血再灌注脑组织血脑屏障通透性的影响 结果显示:与假手术组相比，模型组大鼠脑组织EB水平明显升高，差异显著 (P＜0.01);与模型组相比，各用药组大鼠脑组织EB水平明显降低 (P＜0.01或 P＜0.05)，以脉络宁高剂量组减低最为显著 (P＜0.01)。见表1。

表1 脉络宁对脑缺血再灌注大鼠脑组织血脑屏障通透性的影响 (，n=3)Tab.1 Effects of Mailuoning on permeability of bloodbrain barrier in brain tissue of I/R rats(，n=3)

表1 脉络宁对脑缺血再灌注大鼠脑组织血脑屏障通透性的影响 (，n=3)Tab.1 Effects of Mailuoning on permeability of bloodbrain barrier in brain tissue of I/R rats(，n=3)

注:与假手术组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

组别 动物/只 剂量 EB水平/(μg·g－1)5.85±0.28模型组 3 － 26.55±3.46＊＊依达拉奉 3 3 mg/kg 17.32 ±2.87＊▲脉络宁组(高) 3 4 mg/kg 10.53±1.56＊▲▲脉络宁组(中) 3 2 mg/kg 18.46 ±1.31＊▲脉络宁组(低) 3 1 mg/kg 20.58±2.56假手术3－＊▲

3.3 脉络宁对脑缺血再灌注大鼠ZO-1、occludin蛋白表达的影响 结果显示，与假手术组相比，模型组脑组织中ZO-1和occludin的表达量明显下降(P＜0.01)，表明紧密连接的破坏;与模型组相比，各给药组ZO-1和occludin两种蛋白的表达均明显增加 (P＜0.01或P＜0.05)，以脉络宁高剂量组降低最为显著，显示了脉络宁对内皮细胞紧密连接的保护作用。见图2。

4 讨论

血脑屏障是维持脑内微环境稳定、保障大脑正常功能的重要生理屏障［1］。脑缺血后血脑屏障的损伤既是损伤结果，也是进一步触发损伤的原因，是脑缺血级联损伤的重要病理过程。本实验采用依文思蓝渗透法检测通透性，结果显示，模型组EB水平明显增加，与假手术组比较有显著差异，说明脑缺血再灌注可造成血脑屏障的损伤，使血脑屏障的通透性增加;与模型组比较脉络宁各剂量组脑EB水平均有所降低，表明脉络宁能有效降低脑缺血再灌注所致的血脑屏障通透性增加，对血脑屏障结构有一定的保护作用。

图2 脉络宁对脑缺血再灌注大鼠脑组织ZO-1、occludin蛋白表达的影响 (，n=3)Fig.2 Effects of Mailuoning on ZO-1，occludin proteins expression in brain tissue of I/R rats(，n=3)

血脑屏障主要包括3层结构:脑血管内皮细胞、基底膜和星形胶质细胞终足。脑微血管内皮细胞之间的紧密连接 (tightjunction)是细胞间的通透屏障，通过细胞旁路径调控水、离子和大分子物质的跨膜转运［9］。紧密连接由ZO-1、occludin及细胞骨架蛋白等相连而成。ZO-1和occludin是内皮细胞紧密连接的主要结构蛋白，ZO-1在紧密连接的组成中居于核心地位［10］。有多项研究表明，紧密连接蛋白表达量的改变，位置分布的变化或结构功能的异常均可能破坏紧密连接的完整性，引起细胞间连接的开放，导致血脑屏障通透性的改变［11-12］。多项研究表明，急性脑缺血的情况下，血脑屏障的通透性增加，生理状态下不能通透的物质可以穿越血脑屏障，到达组织间隙［13-14］。本实验结果显示，脑缺血再灌注24 h后模型组大鼠缺血区脑组织ZO-1和occludin蛋白表达明显下降，说明血脑屏障的结构基础破坏，导致血脑屏障通透性的改变，加重脑缺血再灌注损伤。脉络宁能显著提高ZO-1和occludin蛋白的表达，改善血脑屏障功能，起到脑缺血再灌注损伤的保护作用。

综上所述，脉络宁对脑缺血再灌注后血脑屏障的破坏有保护作用，其机制可能与上调ZO-1和occludin，修复微血管内皮细胞之间的紧密连接有关。

［1］Abbott N J，Patabendige A A，Dolman D E，et al.Structure and function of the blood-brain barrier［J］.Neurobiol Dis，2010，37(1):13-25.

［2］Banks W A，Erickson M A.The blood-brain barrier and immune function and dysfunction［J］.Neurobiol Dis，2010，37(1):26-32.

［3］吴 婷，张 军，周 玲，等.HPLC同时测定脉络宁注射液中8种主要成分的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(22):101-105.

［4］张 军，陈 玟，居文政，等.脉络宁注射液中肉桂酸血药浓度的LC-MS-MS测定及人体药动学研究［J］.中国中药杂志，2010，35(14):033.

［5］程启友.脉络宁注射液治疗脑梗死临床分析［J］.中国医学工程，2012，20(9):174-174.

［6］杨蕊平.脉络宁联用依达拉奉治疗急性脑梗死临床观察［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2012，10(8):1012-1012.

［7］肖灵辉，骆 俊.脉络宁治疗急性脑梗塞疗效观察［J］.临床急诊杂志，2012，13(5):340-341.

［8］Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［9］Abbott N J，Patabendige A A，Dolman D E，et al.Structure and function of the blood-brain barrier［J］.Neurobiol Dis，2010，37(1):13-25.

［10］Chen D，Wei X T，Guan J H，et al.Inhibition of c-Jun N-terminal kinase prevents blood-brain barrier disruption and normalizes the expression of tight junction proteins clautin-5 and ZO-1 in a rat model of subarachnoid hemorrhage［J］.Acta neurochirurgica，2012，154(8):1469-1476.

［11］Liu J Y，Thom M，Catarino C B，et al.Neuropathology of the blood-brain barrier and pharmaco-resistance in human epilepsy［J］.Brain，2012，135(10):3115-3133.

［12］Pop V，Sorensen D W，Kamper J E，et al.Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with β-amyloid and cognitive changes in adulthood［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2012，33(2):205-214.

［13］Jiang Q，Ewing J R，Chopp M.MRI of blood-brain barrier permeability in cerebral ischemia［J］.Translat Stroke Res，2012，3(1):56-64.

［14］Huang S，Kim J K，Atochin D N，et al.Cerebral blood volume affects blood-brain barrier integrity in an acute transient stroke model［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33(6):898-905.