刘 毅，冯晓桃，2*，王文健，汪天湛，陈 熤，陈伟华

(1.复旦大学附属华山医院中西医结合研究所，上海 200040;2.广西中医药大学，广西南宁 530001)

骨骼肌组织是胰岛素最大的靶组织，在胰岛素介导的葡萄糖利用方面起着重要的作用［1］。胰岛素诱导骨骼肌葡萄糖利用功能下降，可以导致骨骼肌器官特异性胰岛素抵抗。前期研究显示活血化瘀中药蒲黄提取物——蒲黄总黄酮能提高高糖高胰岛素所致胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取，显示蒲黄总黄酮具有改善胰岛素抵抗的潜在效应［2］。本研究旨在通过观察蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗及Src蛋白表达的影响，探讨蒲黄总黄酮改善胰岛素抵抗潜在机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)培养基、胎牛血清和马血清来自Gibco公司;牛血清白蛋白 (bovine serum albumin，BSA)和胰岛素购自Sigma公司;抗β-arrestin-2和抗Src抗体购自Santa Cruz公司;抗p-Src(Tyr416)抗体由Calbiochem公司提供;抗p-Akt(Ser473)抗体购自Cell Signaling公司;蒲黄总黄酮由上海信谊药业有限公司提供，纯度为85%。

1.2 细胞培养和分化 C2C12骨骼肌细胞株购自美国菌种保藏中心，用含10%胎牛血清DMEM培养。当细胞生长至接触抑制时，将培养液换成含2%马血清DMEM诱导细胞分化，诱导分化4 d，95%以上细胞出现肌管可用于实验［3］。培养液每2 d换1次。

1.3 葡萄糖消耗分析 将96孔板中分化成熟的细胞用含1%BSA低糖 DMEM孵育12 h，然后换上含胰岛素(10 nmol/L)及不同终质量浓度蒲黄总黄酮 (0、0.1、0.25、0.5 g/L)的含1%BSA的DMEM培养基孵育。分别培养8、16、24 h后，葡萄糖氧化酶法检测每孔培养基葡萄糖量。用不含细胞的培养孔内培养基葡萄糖量均值减去各组培养孔培养基中剩余的葡萄糖量，即为每孔细胞葡萄糖消耗量。

1.4 免疫印迹和免疫共沉淀分析 细胞分化成熟后以1%BSA低糖DMEM孵育12 h，然后分为对照组和蒲黄总黄酮组，予含或不含0.5 g/L蒲黄总黄酮培养液孵育16 h，接着予或不予胰岛素 (100 nmol/L)刺激30 min。收集细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。样品与抗β-arrestin-2抗体孵育，沉淀物目标蛋白用免疫印迹法鉴定。取等量蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离，电转移，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，一抗、二抗孵育。化学发光法显影曝光，凝胶图像处理系统分析目标蛋白印迹条带。

2 结果

2.1 蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗的影响如图1所示，与对照组比较，胰岛素在8、16、24 h 3个时间点上都能显著提高C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗。而与胰岛素组相比较，蒲黄总黄酮干预8 h，只有蒲黄总黄酮0.5 g/L+胰岛素组能显著提高细胞的葡萄糖消耗 (P＜0.05);干预16 h，蒲黄总黄酮0.25 g/L+胰岛素组和蒲黄总黄酮0.5 g/L+胰岛素组均能显著提高细胞的葡萄糖消耗(P＜0.05或P＜0.01);而干预24 h，3个质量浓度 (0.1、0.25、0.5 g/L)蒲黄总黄酮+胰岛素组都能明显提高细胞的葡萄糖消耗 (P＜0.05或P＜0.01)。提示蒲黄总黄酮呈时间和质量浓度依赖性提高C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗。

2.2 蒲黄总黄酮对Src蛋白表达的影响 如图2所示，在基础状态下，蒲黄总黄酮干预C2C12骨骼肌细胞16 h能提高Src蛋白表达，是对照组的1.72倍，差异显著 (P＜0.01);而蒲黄总黄酮干预细胞16 h后，再予胰岛素刺激30 min，蒲黄总黄酮也能提高Src蛋白表达，是胰岛素组的1.67倍，差异明显 (P＜0.01)。

图1 蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗的影响

2.3 蒲黄总黄酮对p-Src蛋白表达的影响 如图2显示，在无胰岛素刺激状态下，蒲黄总黄酮干预C2C12骨骼肌细胞16 h对Src磷酸化水平无显著影响 (P＞0.05);而蒲黄总黄酮干预细胞16 h后，再予胰岛素刺激30 min，蒲黄总黄酮能提高Src磷酸化水平，是胰岛素组的1.54倍，差异显著 (P＜0.01)。

图2 蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞Src蛋白表达及其磷酸化水平的影响

2.4 蒲黄总黄酮对Src相关信号复合物的影响 实验以βarrestin-2抗体为一抗，采用免疫共沉淀法检测Src相关信号复合物，并用免疫印迹法鉴定其中的目标蛋白。如图3所见，在无胰岛素刺激状态下，Src相关信号复合物形成很少，蒲黄总黄酮干预16 h也无明显促进作用。但胰岛素刺激30 min能显著促进Src相关信号复合物形成，与此相比较，蒲黄总黄酮干预16 h，再予胰岛素刺激30 min，蒲黄总黄酮能显著提高Src相关信号复合物形成，而且Src(Tyr416)磷酸化水平及其下游Akt(Ser473)磷酸化水平都显著提高。

3 讨论

图3 蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞Src相关信号复合物的影响

蒲黄性平味甘，入肝经和心包经，具有活血化瘀、止血、通淋等功效。现代药理学研究证实蒲黄具有调节脂质代谢和免疫应答，降低血小板聚集、促进纤溶、抗血栓和促凝血双向调节作用［4］。近年来，蒲黄已广泛用于临床治疗2型糖尿病、代谢综合征、非酒精性脂肪肝等以胰岛素抵抗为病理生理学基础的疾病，但其机制尚未完全清楚。本研究表明，蒲黄总黄酮能提高C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗，从而促进细胞葡萄糖利用，这与先前的报道相一致［2］，表明蒲黄总黄酮具有改善胰岛素抵抗的作用。

Src是一种酪氨酸激酶，能够通过其SH3结构域直接作用于Akt，并且这种相互作用是Akt磷酸化活化的基础［5］。Src活性主要由其酪氨酸磷酸化位点所调控，其中激酶区Tyr416磷酸化能上调Src活性［6］。最近研究表明，依赖于胰岛素刺激，Src借助β-arrestin-2蛋白桥接作用与其上游胰岛素受体 (InsR)和下游Akt形成信号复合物，刺激信号由InsR传递到Src并使其Tyr416磷酸化而被活化，随后 Src磷酸化 Akt，进而促使 Akt自身 Thr308和Ser473磷酸化，从而促进细胞葡萄糖消耗和利用［7-8］。使用Src特异性阻断剂PP2可抑制Src活性，导致发生胰岛素抵抗，抑制细胞葡萄糖利用［8-9］。众所周知，游离脂肪酸Palmitate可以引起胰岛素抵抗，其中关键机制之一就是在胰岛素刺激下Src酪氨酸磷酸化水平受限［9-10］。在实验研究中发现，蒲黄总黄酮不仅能够提高骨骼肌细胞Src蛋白表达量，而且还能提高其Tyr416磷酸化水平。项目组曾报道过［11］，蒲黄总黄酮能够改善Palmitate抑制骨骼肌细胞葡萄糖消耗和摄取，提高细胞的胰岛素敏感性。据此，可以推测蒲黄总黄酮提高C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗很有可能与Src蛋白表达上调及其信号复合物形成有密切的关系。为了证明这一点，项目组采用免疫共沉淀技术进行实验，发现蒲黄总黄酮能促进Src相关信号复合物形成，而且在该复合物中，Src(Tyr416)磷酸化水平显著提高，进而引起Akt(Ser473)明显磷酸化。曾报道蒲黄总黄酮能提高β-arrestin-2蛋白表达，而这也有利于Src相关信号复合物的形成［8，12］，与本研究结果相一致。

因此，蒲黄总黄酮能提高C2C12骨骼肌细胞Src蛋白表达及其磷酸化水平，进而促进其信号复合物形成，这可能是蒲黄总黄酮改善胰岛素抵抗的机制之一。

［1］Baron A D，Brechtel G，Wallace P，et al.Rates and tissue sites of non-insulin-and insulin-mediated glucose uptake in humans［J］.Am J Physiol，1988，255(6 Pt 1):E769-E774.

［2］何燕铭，王文健，陈伟华，等.蒲黄总黄酮对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响［J］.中西医结合学报，2006，4(6):593-595.

［3］Jové M，Planavila A，Sánchez RM，et al.Palmitate induces tumor necrosis factor-alpha expression in C2C12 skeletal muscle cells by a mechanism involving protein kinase C and nuclear factor-kappaB activation［J］.Endocrinology，2006，147(1):552-561.

［4］Ohkura N，Tamura K，Tanaka A，et al.Experimental study on the hemostatc activity of Pollen Typhae:a traditional folk medicine used by external and oral application［J］.Blood Coagul Fibrinolysis，2011，22(8):631-636.

［5］Jiang T，Qiu Y.Interaction between Src and a C terminal praline-rich motif of Akt is required for Akt activation［J］.J Biol Chem，2003，278(18):15789-15793.

［6］Hunter T.A tail of two src＇s:mutatis mutandis［J］.Cell，1987，49(1):1-4.

［7］Lodeiro M，Theodorpoulou M，Pardo M，et al.c-Src regulates Akt signaling in response to ghrelin via beta-arrestin signalingindependent and-dependent mechanisms［J］. PLoS One，2009，4(3):e4686.

［8］Luan B，Zhao J，Wu H，et al.Deficiency of a β-arrestin-2 signal complex contributes to insulin resistance［J］.Nature，2009，457(7233):1146-1150.

［9］Feng X T，Wang T Z，Leng J，et al.Palmitate contributes to insulin resistance through downregulation of the Src-mediated phosphorylation of Akt in C2C12 myotubes［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2012，76(7):1356-1361.

［10］Holzer R G，Park E J，Li N，et al.Saturated fatty acids induce c-Src clustering within membrane subdomains，leading to JNK activation［J］.Cell，2011，147(1):173-184.

［11］娄少颖，刘 毅，陈伟华，等.蒲黄总黄酮对Palmitate培养下的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖代谢的影响［J］.上海中医药大学学报，2008，22(2):39-42.

［12］冯晓桃，刘 毅，汪天湛，等.蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞β-arrestin-2基因及蛋白表达的影响［J］.中华中医药杂志，2012，27(9):2299-2302.