王孝勋，郭振旺，李耀华，梁臣艳*，梁 丹

(1.广西中医药大学，广西南宁 530001;2.广西壮族自治区梧州食品药品检验所，广西梧州 543002)

对叶百部为百部科植物对叶百部Stemona tuberosa Lour.的干燥块根，具有润肺下气止咳、杀虫灭虱的功效，用于新久咳嗽、肺痨咳嗽、百日咳;外用于头虱、体虱、蛲虫病、阴痒。现代药理研究表明百部根的提取物具有抑菌［1］、抗真菌［2］、抗病毒［3］、杀虫［4］、止咳［5］等作用。对叶百部为《中国药典》2005年版、2010年版所收载百部药材的3个来源品种之一［6］，为多基原药材。但百部项下仅有性状、鉴别、浸出物等项目，质量标准研究较为薄弱，缺乏有效成分的量化评价指标。对于多基原药材应分别进行研究，制定能反映其内在质量的规范标准［7］。生物碱是百部的脂溶性部位的主要成分，同时也是百部提取物的主要活性成分［8-10］。广西为对叶百部的主要产地［11-13］，但未见对叶百部生物碱成分的定量测定文献报道。本实验用硅胶柱色谱法、制备液相等分离方法从对叶百部中分离了氧化对叶百部碱，并用HPLC法建立了中药对叶百部中氧化对叶百部碱的定量测定，为完善中药材对叶百部的质量标准提供实验依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200分析型高效液相色谱仪 (美国Aglient公司、DAD检测器);LC-8A半制备型高效液相色谱仪 (日本岛津公司);RE-52型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂);Millipore Simplicity-185超纯水仪 (美国Millipore公司);BP211D型电子分析天平 (德国Sartorius公司);KQ5200DB超声波清洗仪 (江苏昆山市超声仪器有限公司);X-4数字显示显微熔点测定仪 (北京泰克仪器有限公司);柱色谱和薄层色谱用硅胶均系青岛海洋化工厂生产;乙腈为色谱纯 (美国Fisher公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯;氧化对叶百部碱对照品 (自制，纯度98.1%)。

对叶百部药材采自广西各地，经广西中医药大学药学院药用植物教研室韦松基教授鉴定为百部科百部属植物对叶百部Stemona tuberosa Lour.的块根，标本存放于广西中医药大学药学院。

2 方法与结果

2.1 氧化对叶百部碱的提取、分离和结构鉴定取对叶百部药材3 kg，粉碎，加乙醇30 L于85℃回流提取2次，每次2 h，提取液过滤、合并，滤液80℃减压浓缩成糖浆状，得稠浸膏约1 kg。稠浸膏用4700 mL 4%盐酸溶解，酸水液过滤，滤液加1000 mL氨水调pH到9，碱水液用三氯甲烷萃取2次 (三氯甲烷总用量4800 mL)，合并三氯甲烷层，三氯甲烷层用水洗涤1次 (水总用量3600 mL)，分取三氯甲烷层，减压回收三氯甲烷，得总生物碱约30 g，得率为1%。取总生物碱30 g，甲醇溶解，硅胶60 g拌样;上柱，硅胶600 g(柱径比1∶9);以三氯甲烷→三氯甲烷-甲醇 (95∶5→90∶10→85∶15)→甲醇梯度洗脱。取三氯甲烷-甲醇 (95∶5)洗脱液，经减压浓缩后得洗脱物约15 g。取洗脱物经多次半制备HPLC法和重结晶，得到无色细针状结晶22 mg，经分析型HPLC分析纯度为98.1%。经结构鉴定为氧化对叶百部碱，结构式见图1。

图1 氧化对叶百部碱结构式Fig.1 Structural formula of oxotuberostemonine

无色细针状结晶 (甲醇)。mp 89～91℃ (温度未校正)。薄层显色反应:以三氯甲烷-甲醇(80∶20)展开，改良碘化铋钾显色为橘红色。

EI-MS(m/z):389［M］+(44)，360［MC2H5］+(100)，290 ［M-C5H7O2］+(78)。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ:2.05(1H，m，2-Hα)，1.60(1H，m，2-Hβ)，3.65(1H，m，3-H)，3.42(1H，m，5-H)，3.30(1H，m，5-H)，1.85(2H，m，6-H)，1.50(2H，m，7-H)，2.61(1H，t，8-Hα)，2.45(1H，m，8-Hβ)，2.40(1H，m，H-10)，4.26(1H，m，H-11)，3.05(1H，dd，J=8.1，11.7 Hz，12-H)，2.23(1H，m，13-H)，1.35(3H，d，J=7.2，15-H)，1.40(2H，m，16-H)，0.98(3H，d，J=6.6，17-H)，3.98(1H，s，18-H)，2.15(1H，m，19-Hα)，1.80(1H，t，J=10.5，9.9，12.0 Hz，19-Hβ)，2.72(1H，m，20-H)，1.22(3H，d，J=6.9 Hz，22-H)。13C-NMR(CD3OD，100MHz)δ:87.07(C-1)，37.72(C-2)，66.73(C-3)，53.33(C-5)，26.02(C-6)，32.67(C-7)，34.57(C-8)，142.22(C-9)，122.23(C-9a)，42.68(C-10)，67.21(C-11)，38.96(C-12)，52.63(C-13)，181.98(C-14)，15.02(C-15)，27.04(C-16)，9.50(C-17)，85.12(C-18)，34.75(C-19)，36.19(C-20)，181.55(C-21)，13.17(C-22)。以上数据与文献 ［14］报道基本一致，鉴定为氧化对叶百部碱。

2.2 色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流动相为乙腈-水溶液(45∶55)，体积流量为1.0 mL/min，检测波长242 nm，柱温30℃。进样量20 μL。在此色谱条件下，样品在与对照品相对应的保留时间出现相同的色谱峰，理论塔板数4000以上，分离度大于1.5。见图2。

图2 氧化对叶百部碱对照品及对叶百部药材HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of oxotuberostemonine and Stemona tuberose

2.3 对照品溶液的制备 取氧化对叶百部碱对照品适量，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制得每1 mL含0.141 mg的对照品贮备液。

2.4 供试品溶液的制备 取干燥对叶百部样品粉末约1 g，精密称定，加入甲醇50 mL，超声提取40 min，滤过，滤渣继续加入50 mL甲醇，超声提取40 min，滤过，合并2次滤液，浓缩定容到2 mL量瓶中。浓缩液经10000 r/min离心15 min，即得供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 取氧化对叶百部碱对照品贮备液1、2、4、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分别取5个不同质量浓度的对照品溶液按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱峰峰面积。以氧化对叶百部碱进样量 X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得氧化对叶百部碱回归方程为 Y=523.7X-10.57，r=0.9997。结果表明氧化对叶百部碱在0.282～2.82 μg之间呈良好的线性关系。

2.5.2 精密度试验 取对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，分别测定氧化对叶百部碱峰面积，RSD为0.81%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(广西上思)，按“2.2”项下色谱条件分别在0、4、8、12、16、20、24 h注入高效液相色谱仪，测定氧化对叶百部碱的峰面积，RSD为0.35%，结果表明本实验在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批对叶百部药材 (广西上思)约1 g，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录氧化对叶百部碱的峰面积，计算，平均含有量为2.67 mg/g，RSD为0.26%，结果表明本法重复性较好。

2.5.5 加样回收试验 取6份已知含有量的样品粉末 (广西上思)，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入与药材相当量的氧化对叶百部碱对照品。按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，记录氧化对叶百部碱的峰面积，计算平均回收率为99.63%，RSD为1.9%。

表1 氧化对叶百部碱加样回收考察结果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.6 样品测定 分别取10批药材样品粉末约1 g，每批样品平行3份，精密称定。按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析测定。根据标准曲线计算氧化对叶百部碱的量，结果见表2。

表2 10批药材样品中氧化对叶百部碱的测定结果 (n=3)Tab.3 Determination of oxotuberostemonine in Stemona tuberose(n=3)

3 讨论

本研究采用甲醇超声提取、HPLC法测定对叶百部中氧化对叶百部碱的量，结果表明10批药材样品中均含有一定量的氧化对叶百部碱，平均含有量为2.99 mg/g。但不同产地的药材中氧化对叶百部碱的量相差较大，其中广西大新最高 (5.83 mg/g)，广西隆林含有量最低 (0.69 mg/g)，含有量最高值和最低值相差8倍以上，说明对叶百部药材的质量存在较大的差异。这可能与各地土壤状况、日照强度、栽培条件、栽培时间、采集季节等因素有关，原因有待进一步探讨。

对叶百部是《中国药典》收载的百部品种来源之一，其成分研究比较深入，报道较多，但现行药典中尚无成分定量测定，有关氧化对叶百部碱的定量测定也未见报道，本研究以各产地药材中制备分离得到的共有化合物氧化对叶百部碱为指标进行质量评价，该方法简单、可行，可在一定程度上反映对叶百部药材的质量，可以考虑以其为对照品，评价其质量。为保证评价方法的科学性和可操作性，应考虑深入研究氧化对叶百部碱的生源途径、理化性质、稳定性及其药效。

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