HPLC-DAD法同时测定调更汤中3个活性成分

2014-11-04侯剑伟徐莲薇

中成药 2014年7期

侯剑伟，丁越，张彤*，徐莲薇

(1.上海中医药大学，上海 201203;2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

调更汤主要由白芍、地黄、首乌藤、淫羊藿等药味组成。在临床上用于治疗围绝经期综合征，改善烘热汗出、情志异常、失眠等症状，效果良好［1］。方中淫羊藿温阳，白芍敛阴，首乌藤味甘性平，能较好地调节植物神经。整方调节患者脏腑阴阳失衡，改善患者肾阴虚、肝血不足的现象［2］。为了更好控制调更汤质量，本实验建立了一种同时测定调更汤中白芍有效成分芍药苷［3-4］、首乌藤有效成分 2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［5］、淫羊藿主要成分淫羊藿苷的高效液相色谱法［6］。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪 (Agilent-1100型，包括G1315A二极管阵列检测器，美国 Agilent公司)，Chemstations色谱工作站 (美国 Agilent公司)，AG285电子天平 (0.01 mg，瑞士METTLER公司)。

1.2 试药芍药苷 (批号20110926)、淫羊藿苷(批号20111123)、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 (批号20120415)对照品均购自上海源叶生物技术有限公司，纯度均大于98%。调更汤 (上海中医药大学制，批号分别为20120721、20120722、 20120723、 20130422、 20130424、20130425)。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸水，其他所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil-C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相 A为蒸馏水，B为乙腈，梯度洗脱 (0～10 min，15%B;10～30 min，15% ～25%B;30～40 min，25% ～50%B);柱温30℃;体积流量1 mL/min;检测波长芍药苷230 nm，2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷320 nm，淫羊藿苷270 nm;进样量为20 μL。在上述条件下，样品中各对照品与其他组分达到基线分离，与相邻的色谱峰分离度大于1.5。各对照品峰理论塔板数不小于3000。结果见图1。

2.2 混合对照品溶液的制备取干燥至恒重的对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL含芍药苷、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分别为0.193 mg/mL、0.204 mg/mL、0.353 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备精密量取调更汤样品1 mL，置10 mL量瓶中蒸馏水定容，吸取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过即可。

2.4 方法学研究

2.4.1 测定波长的选择根据《中国药典》2010年版，设定230 nm(芍药苷)、270 nm(淫羊藿苷)、320 nm(2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)。

图1 对照品 (A)与不同波长下调更汤样品 (B～D)HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Tiaogeng Decoction samples in differen wavelengths(B-D)

2.4.2 线性关系考察以混合对照品溶液为母液，对半稀释，分别配制成一系列质量浓度的对照品溶液。分别吸取上述的对照品溶液各20 μL，进样测定。以峰面积为纵坐标，质量浓度 (μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程，结果见表1。

表1 回归方程Tab.1 Regression equation

2.4.3 精密度试验精密吸取高中低3个质量浓度的混合对照品溶液20 μL，重复进样5次，依“2.1”项色谱条件测定。按峰面积计算RSD值。其中芍药苷高中低3个质量浓度的RSD分别为0.12%、0.62%、1.3%。2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷高中低3个质量浓度的RSD分别为1.7%、1.0%、0.41%。淫羊藿苷高中低3个质量浓度的 RSD分别为0.46%、0.26%、0.81%。结果表明，仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验取批号20120723样品，按“2.3”项供试品液制备方法制备，于0、3、6、12、24 h按“2.1”项下色谱条件测定。芍药苷、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷3个化合物峰面积RSD分别为2.5%、2.6%和1.4%。结果表明，在24 h内供试品溶液基本稳定。

2.4.5 重复性试验取批号20120723样品，按“2.3”项制备供试品液6份，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积，计算。结果样品中芍药苷、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分别为1.125、0.1764、0.7560 mg/mL。RSD分别为1.8%、2.7%、1.7%。表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验精密移取调更汤水煎液(批号20120723)0.5 mL 9份，每3份为一组，按高中低 (即80%、100%、120%)比例精密加入一定量的对照品贮备液，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定样品，计算回收率，结果见表2。

2.5 样品测定取6批调更汤样品 (批号20120721、 20120722、 20120723、 20130422、20130424、20130425)。每批各 6份。按 “2.3”项方法制备各样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。以每1 mL含芍药苷、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷分别为0.193、0.204、0.353、0.0121、0.0137、0.0221 mg/mL的高低两种混合对照品溶液，按外标两点法以峰面积计算样品中3种成分量。结果见表3。

表2 加样回收率试验结果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

3 讨论

3.1 采用HPLC法测定了调更汤水煎剂中有效成分的量。参考相关文献［7-15］，对乙腈-水，甲醇-磷酸水及乙腈-磷酸水流动相系统进行了考察，最终采用乙腈-水系统进行梯度洗脱，能同时测定其中芍药苷、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷3种成分的量，并进行了方法学考察，结果表明该方法简便快速，精密度、重复性、回收率良好，可作为调更汤的质量控制方法。