高 霞，陈 彦*，王 莹，周 静

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210023;2.江苏省中医药研究院中药新型给药系统重点实验室，国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室，江苏南京 210028)

淫羊藿是传统的补肾中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用［1］。淫羊藿中黄酮成分是主要活性成分，主要有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等黄酮苷类［2］。现代药理研究表明淫羊藿总黄酮具有很好的抗骨质疏松等作用［3-5］，但口服需经过肠道内酶和菌的酶解作用转化成为次级苷才能够很好地吸收发挥作用［6］。由于人体肠道内存在的水解酶 (肠道黏膜酶和肠道菌酶)因人种、年龄、饮食、药物的影响而不同［7-9］，因此难以保证口服淫羊藿黄酮后能稳定快速的被水解吸收，并保持较好的抗骨质疏松等药效。基于淫羊藿黄酮苷肠道酶解特点，课题组形成了构建外加水解酶、药物、功能辅料三位一体的适宜于淫羊藿总黄酮肠道内“实时酶解”、“实时吸收”的仿生酶解口服给药系统的研究思路。课题组在前期成功地在体外用蜗牛酶酶解淫羊藿总黄酮模拟其体内过程，本实验将探讨制剂成型过程中的制粒因素对淫羊藿总黄酮酶解可能产生的影响，为淫羊藿总黄酮仿生酶解口服给药系统构建的可行性积累实验数据。

1 仪器与材料

Agilent 1200型高效液相色谱仪 (DAD检测器，四元泵，美国Agilent公司);数显气浴恒温振荡器 (金坛市双捷实验仪器厂);METTLER AL204十万分之一天平 (瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);离心机 (长沙湘智离心机仪器有限公司)。

淫羊藿 (购自吉林敦化，经南京中医药大学吴德康教授鉴定为朝鲜淫羊藿);蜗牛酶 (上海源叶生物科技有限公司);淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷Ⅰ对照品 (上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%)，淫羊藿苷元对照品 (自制，纯度﹥98%);糊精 (国药集团化学试剂有限公司，批号F20100816);乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿总黄酮提取物的制备 称取淫羊藿300 g，加15倍量50% 乙醇回流提取两次，每次2 h，合并两次滤液，回收乙醇［10］，真空干燥，得含4.44 g生药/g的淫羊藿总黄酮粉末。

2.2 含酶淫羊藿总黄酮颗粒的制备 取蜗牛酶125 mg和糊精3 g混匀，再加入淫羊藿总黄酮粉末675 mg，混匀，加适量水制软材，过20目筛制粒，低温干燥，得含酶淫羊藿总黄酮颗粒。

2.3 淫羊藿总黄酮的体外酶解 取淫羊藿总黄酮粉末27 mg，加入10 mL pH 6.0的HBSS平衡盐溶液中，放入37℃ 恒温振荡器中保温。取蜗牛酶5 mg，用10 mL的pH 6.0的HBSS平衡盐溶液溶解。将酶液加至等量的淫羊藿提取物溶液中，在37℃恒温振荡器中反应。另称取含酶淫羊藿总黄酮颗粒152 mg，置于锥形瓶中，加入pH 6.0的HBSS缓冲溶液20 mL，放入37℃恒温振荡器中反应，分别在0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h时取上述两种反应液各150 μL，立即加300 μL乙醇终止反应，涡旋，离心后进HPLC仪分析测定，比较淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及其酶解产物宝藿苷Ⅰ、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ和淫羊藿苷元的量变化。实验平行3次。

2.4 HPLC测定酶解液中6种主要黄酮成分的分析方法的建立

2.4.1 色谱条件 Zorbax SB C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-水，梯度洗脱 (0～15 min，10% ～25% 乙腈;15～38 min，25% 乙腈;38～61 min，25% ～71% 乙腈;61～75 min，71% ～100% 乙腈);检测波长270 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃。色谱图见图1。

图1 对照品 (A)、酶解前样品 (B)和酶解后样品 (C)的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，unenzymolysis sample(B)and enzymolysis sample(C)

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷5.33 mg，朝藿定A 8.42 mg，朝藿定 B 9.05 mg，朝藿定C 8.26 mg，宝藿苷Ⅰ5.26 mg，淫羊藿苷元7.50 mg，加无水乙醇溶解稀释至10 mL，作为贮备液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取转化后的混悬液适量，立即加无水乙醇终止反应，涡旋，离心后即得。

2.4.4 标准曲线的绘制 精密量取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元贮备液适量，加无水乙醇稀释成不同质量浓度的对照品溶液。所含朝藿定A分别为2.6、5.3、10.5、21.0、42.1、84.2、168.4 μg/mL，所含朝藿 定 B 分 别 为 1.4、2.8、5.7、11.3、22.6、45.2、90.5、181.0 μg/mL，所含朝藿定C分别为2.6、 5.2、 10.3、 20.6、 41.2、 82.6、 165.2 μg/mL，所含淫羊藿苷分别为 1.7、3.3、6.7、13.3、26.6、53.3、106.6 μg/mL，所含宝藿苷Ⅰ分 别 为 3.3、6.6、13.2、26.3、52.6、105.2 μg/mL，所含淫羊藿苷元分别为4.7、9.4、18.8、37.5、75.0、150.0 μg/mL。分别精密吸取各对照品溶液10 μL，进样测定，记录峰面积。以质量浓度 (x，μg/mL)为横坐标，峰面积 (y)为纵坐标，进行线性回归，得6种成分的回归方程、相关系数和线性范围。朝藿定A的线性回归方程为y=17.443x+23.584，r=0.999;朝藿定B的线性回归方程为y=27.196 x+21.610，r=0.999;朝藿定C的线性回归方程为y=18.415x+19.589，r=1.000;淫羊藿苷的线性回归方程为y=30.459x+24.061，r=0.999;宝藿苷Ⅰ的线性回归方程为y=24.718x+23.400，r=0.999;淫羊藿苷元的线性回归方程为y=6.895x－37.550，r=0.999。实验结果表明朝藿定A在0.026～1.684 μg，朝藿定B在0.014～1.810 μg，朝藿定C在0.026～1.652 μg，淫羊藿苷在 0.017～1.066 μg，宝藿苷Ⅰ在0.033～1.052 μg，淫羊藿苷元在 0.0470 ～1.500 μg都呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取上述各对照品溶液10 μL，连续进样 6次，测定峰面积，计算RSD值。结果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分别是0.4%、1.0%、0.1%、0.8%、1.0%、1.5%。表明仪器的精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取上述供试品溶液，室温放置，分别于 0、1、2、4、8、12和 24 h进样10 μL，测定各成分的峰面积，计算RSD值。结果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分别是0.6%、1.4%、0.3%、0.8%、1.2%、1.8%。表明样品溶液在24 h内稳定。

2.4.7 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，进样10 μL，测定各成分的峰面积，计算RSD值，结果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分别是0.6%、1.7%、0.2%、1.1%、1.5%、2.0%。表明样品的重复性较好。

2.4.8 加样回收率试验 精密量取已知朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元质量浓度的供试品溶液6份，分别加入一定量的对照品，用无水乙醇稀释至一定浓度并进样10 μL，计算各对照品的平均加样回收率和RSD值。结果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的平均回收率分别为100.0%、99.5%、99.6%、100.2%、99.6%、98.9%;RSD值分别为 0.6%、1.1%、1.2%、1.1%、1.3%、1.4%。

2.5 酶解结果比较

2.5.1 含酶淫羊藿总黄酮颗粒与未制粒的淫羊藿总黄酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的酶解数据见图2。淫羊藿总黄酮粉末与蜗牛酶不经制粒直接反应时，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C都在1 h左右基本酶解完全。经糊精湿法制粒得到的含酶淫羊藿总黄酮颗粒酶解时，淫羊藿苷、朝藿定A和朝藿定C在2 h时基本酶解完全，朝藿定B在3 h基本酶解完全，且三者的初始浓度都略低。实验结果表明，经糊精湿法制粒后淫羊藿总黄酮酶解的速率变慢，这是由于淫羊藿总黄酮与蜗牛酶首先需要从颗粒中释放才能反应，但在3 h内都能基本溶出并酶解，而人体肠道排空时间为4～6 h，因此糊精湿法制粒对含酶淫羊藿总黄酮颗粒中原型黄酮苷的消除影响不大。

图2 糊精湿法制粒对淫羊藿苷与朝藿定A、B、C酶解的影响 (n=3)Fig.2 Enzymolysis changes of icariin，epimedin A，epimedin B ，and epimedin C by dextrin wet granulation(n=3)

2.5.2 淫羊藿总黄酮中淫羊藿苷的酶解产物宝藿苷Ⅰ及终产物淫羊藿苷元质量浓度的变化可知，宝藿苷Ⅰ是淫羊藿苷水解掉C 7位上的葡萄糖生成的次级苷［11］。酶解液中宝藿苷Ⅰ的质量浓度由两方面决定，一方面淫羊藿苷水解生成宝藿苷Ⅰ，另一方面宝藿苷Ⅰ酶解成淫羊藿苷元。淫羊藿总黄酮粉末与蜗牛酶不经制粒直接反应时，宝藿苷Ⅰ的质量浓度在1 h时达到最高值21.87 μg/mL，之后质量浓度逐渐下降，说明它被继续水解成了苷元，6 h时其质量浓度趋于稳定，此时宝藿苷Ⅰ的质量浓度仅有1.81 μg/mL，转化了83.08%。含酶淫羊藿总黄酮颗粒酶解时，宝藿苷Ⅰ的质量浓度在3 h时达到最高值 24.35 μg/mL，之后质量浓度逐渐下降，6 h时宝藿苷Ⅰ的质量浓度为6.75 μg/mL，转化了69.55%。实验结果表明，经糊精湿法制粒后酶解产物宝藿苷Ⅰ的生成速率基本不变，但是水解速率显著变慢，6 h时宝藿苷Ⅰ的质量浓度是未制粒淫羊藿总黄酮酶解时的3.7倍。因此，糊精湿法制粒可以提高酶解液中宝藿苷Ⅰ的量。

淫羊藿苷元是淫羊藿总黄酮水解掉所连接的糖基 (主要是C 3和C 7位上的糖)得到的终产物。淫羊藿总黄酮粉末与蜗牛酶不经制粒直接反应时，淫羊藿苷元的量随酶解时间不断增加，0～4 h基本成线性增加，生成速率约为8.12 μg/(mL·h)，6 h时淫羊藿苷元的质量浓度为30.35 μg/mL。含酶淫羊藿总黄酮颗粒酶解时，淫羊藿苷元的量随酶解时间亦不断增加，0～6 h基本成线性增加，生成速率约为3.43 μg/(mL·h)，6 h时淫羊藿苷元的质量浓度为19.43 μg/mL。与未制粒时相比较，其生成速率提高了2.4倍，6 h时的量提高了1.6倍。实验结果表明，经糊精湿法制粒后酶解产物淫羊藿苷元的生成速率显著变慢，酶解液中的质量浓度也较低。因此，糊精湿法制粒不利于淫羊藿苷元的生成，见图3。

2.5.3 淫羊藿总黄酮中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的酶解产物箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量的变化见图4。箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ分别是朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C水解掉C 7位上的葡萄糖生成的次级苷［11］。箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的单体成分较难获得，因此以峰面积的大小来比较上述3种酶解产物在酶解过程中的变化。淫羊藿总黄酮粉末与蜗牛酶不经制粒直接反应时，箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量在1 h左右达到最高，之后含有量逐渐下降，说明它们被继续水解为其他物质，于6 h时箭藿苷A转化了21.30%，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ转化了18.87%，而箭藿苷B基本不再水解。含酶淫羊藿总黄酮颗粒酶解时，箭藿苷A、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量在2 h左右达到最高，箭藿苷B在3 h左右达到最高，且三者最终趋于稳定的量比未制粒淫羊藿总黄酮酶解时的都略高。实验结果表明，经糊精湿法制粒后箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的生成速率略微变慢，但最终趋于稳定的量都略高。因此糊精湿法制粒有利于提高酶解液中次级苷箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量。

图3 糊精湿法制粒对酶解产物宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的影响 (n=3)Fig.3 Content changes of baohuosideⅠand icaritin by dextrin wet granulation(n=3)

图4 糊精湿法制粒对酶解产物箭藿苷A、B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的影响 (n=3)Fig.4 Content changes of sagittatoside A，sagittatoside B，and 2″-O-rhamnosylicariside Ⅱby dextrin wet granulation(n=3)

3 讨论

本实验将蜗牛酶、淫羊藿总黄酮和糊精混合后制成含酶淫羊藿总黄酮颗粒，考查糊精湿法制粒对蜗牛酶仿生酶解淫羊藿总黄酮的影响。为模拟体内肠道情况，酶解温度选择了37℃，缓冲液选择了pH 6.0的HBSS平衡盐溶液。因为食物与药物一般在人体肠道停留的时间为4～6 h［12］，所以仅考查了6 h内淫羊藿总黄酮的转化情况。蜗牛酶与淫羊藿总黄酮经糊精湿法制粒后酶解，淫羊藿总黄酮中主要原型黄酮成分在3 h内都能完全被酶解，虽酶解速率变慢，但在肠道排空时间内都能溶出并被完全酶解;酶解产物的生成速率也变慢，但是6 h时酶解液中次级苷宝藿苷Ⅰ、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量都相对略高，但淫羊藿苷元的量相对较低，仅有未制粒直接酶解时的64.02%。所以糊精湿法制粒对淫羊藿总黄酮的酶解转化有一定影响。

本实验只是用糊精作为辅料简单制粒，探索淫羊藿黄酮仿生酶解口服给药系统构建的可行性，今后还可以采用多种功能辅料优化制剂成型过程，促进酶解，以提高制剂的生物利用度。此外，由于含酶淫羊藿总黄酮颗粒的酶解行为与未制粒粉末比较有一定差别，其药效是否会有差别还有待进一步实验考查。

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