万 峰，彭 成，曹小玉，熊 亮，魏晓露，周彦希

(1.成都中医药大学，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，中药材标准化教育部重点实验室，四川成都 611137;2.成都康弘药业集团股份有限公司，四川成都 610036)

广藿香为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分，是我国著名南药之一。广藿香精油为广藿香的主要药用成分，有抗菌［1-2］、抗病毒［3］、驱虫［4-5］、抗肿瘤［6］等药理作用。此外，还可以作为化妆品、定香剂、杀虫剂等日用品的生产配料［7］。自 1928年 Alexander Fleming偶然发现青霉素并应用于临床后，人类与感染性疾病的斗争才有了阶段性胜利。但滥用抗生素致使耐药菌急剧增加的现象，无可避免的让我们联想到，“无药可救”的后抗生素时代。有潜力出现新型抗菌药物的中药，以其毒副作用小而备受关注，且中药不易使细菌对其产生耐药性［8］。

综合文献以及本实验室前期研究发现广藿香精油在体外具有很强抑菌活性，但尚未见和其相关的抑菌机理报道。基于此，本实验以金黄色葡萄球菌为供试菌，通过研究广藿香精油对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (MSSA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的体外抑菌活性，对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌曲线、超微结构、细胞壁透性和肽聚糖的量、膜蛋白构象和离子渗漏的影响等方面，来阐述广藿香精油的抑菌活性及作用机制，旨在为开发高效低毒的纯天然抗菌药物提供理论依据。

1 实验材料

1.1 供试药物 广藿香，购自广东省湛江雷州市，经成都中医药大学鉴定教研室李敏老师鉴定为唇形科植物广藿香 Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分。粉碎后用水蒸气蒸馏法［9］提取广藿香精油，经GC-MS［10］测得其中含广藿香醇量为42.1%。临用时用0.5%的吐温-80配置为供试药物。

1.2 菌株 质控菌种金黄色葡萄球菌ATCC 25923和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 43300，临床分离到4株对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和1株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)，现均保存于成都中医药大学药学院药理教研室。实验前将菌种保存液复活接种于LB固体培养基，培养过夜，次日挑取单菌落接种于5～10 mL的LB液体培养基，振荡培养3 h。取100 μL菌液均匀涂布于LB固体平板，倒置培养16～18 h后收集活菌作实验用。

1.3 主要试剂与仪器 Mueller-Hinton agar(OXOID);SLP-HS Single Reagent Set(和光纯药工业株式会所);碘化钾 (KI)(成都市科龙化工试剂厂);碱性磷酸酶 (AKP)试剂盒、Mg试剂盒及K试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。

7890A/5975C气质联用仪 (Agilent)，VARIOSKAN Flash(Thermo scientific)，Tecnai G2 F20(FEI)。

2 实验方法

2.1 体外抑菌活性的测定 采用琼脂平板二倍稀释法测定广藿香精油对受试菌的最低抑菌浓度(MICs)，将过夜培养的细菌稀释成1.5×106CFU/mL，使用多点接种仪接种于含药MH琼脂平板，将平板培养18～24 h后测定广藿香精油对细菌的 MICs［12］。

2.2 抑菌曲线的测定 采用生长曲线法［13］测定广藿香精油对细菌生长的影响，将不同质量浓度的药物组、对照组振荡培养后，使用酶标仪每隔2 h测定其在600 nm的OD值。平行测定3次，绘制生长曲线。

2.3 对超微结构的影响 使用透射电镜观察广藿香精油对细菌超微结构的影响［14］。在含有供试细菌1.5×106CFU/mL的LB液体培养基中，加入广藿香精油使其在菌液中的浓度为1/2 MIC，振荡培养18 h后，收集菌液后按透射电镜样品制备法［15］制样，在电镜下观察菌体外观形态及超微结构。

2.4 对细胞壁透性的影响 在菌液中加入不同质量浓度的广藿香精油，充分混匀后于37℃震荡培养5 min，同时设定药物自身对照组，用酶标仪按碱性磷酸酶试剂盒使用方法于520 nm测定菌液中的碱性磷酸酶活性。同时平行测定3次。

2.5 对细胞壁肽聚糖量的影响 按照肽聚糖检测试剂盒使用方法配制试剂并加入菌液，混匀后于30℃水浴10 min，然后加入不同质量浓度的广藿香精油，混匀后使用酶标仪于650 nm(检测温度30℃，30 s自动检测1次)，连续检测2 min，同时设定药物自身对照组，测定肽聚糖的量，以光密度 (optical density，OD)值表示。同时平行测定3次。

2.6 对细菌胞内钾、镁离子渗漏的测定 在菌液中加入不同质量浓度的广藿香精油，在37℃水浴2 min，按照离子测试试剂盒的使用说明，同时设定药物自身对照组，使用酶标仪检测菌液中含钾、镁离子的量。平行测定3次。

2.7 对膜蛋白构象的影响 固定苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸 (Tyr)、色氨酸 (Trp)3种氨基酸残基在细菌膜蛋白中的发射波长，在200 nm到400 nm范围内扫描它们各自的激发波长。根据Phe、Tyr、Trp 3种氨基酸残基的激发波长Ex，固定Ex，在200 nm到800 nm范围内扫描它们在细菌膜蛋白中的发射波长Em［16］。加入不同浓度的荧光淬灭剂碘化钾，检测碘化钾对3种氨基酸残基发射波长Em的峰位和峰高的影响，确定氨基酸残基位于膜内还是膜外。最后在一定浓度的菌液中加入不同质量浓度的广藿香精油，使用酶标仪检测药物对选定氨基酸残基发射波长Em峰位和峰高的影响。

3 实验结果

3.1 体外抑菌活性 由表1可知，广藿香精油对7株受试细菌均具有较强的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌临床分离病原菌的敏感菌MSSA及耐药菌MRSA的MICs均为0.51 mg/mL。

3.2 对生长曲线的影响 由图1可知，不加入广藿香精油，空白组金黄色葡萄球菌2 h进入对数生长期，14 h进入稳定期;加入0.26 mg/mL的广藿香精油，细菌8 h进入对数生长期，16 h进入稳定期，并很快进入衰亡期，细菌量较空白组明显减少;加入0.13 mg/mL的广藿香精油，细菌6 h进入对数生长期，16 h进入稳定期，细菌量较空白组减少;加入0.06 mg/mL的广藿香精油，细菌4 h进入对数生长期，14 h进入稳定期。结果表明0.26、0.13 mg/mL的广藿香精油均能明显延长金黄色葡萄球菌的延迟期，明显抑制细菌的生长。

表1 广藿香精油的体外抑菌活性Tab.1 In vitro antibacterial activity of the essential oil from Pogostemon cablin

图1 广藿香精油对金黄色葡萄球菌生长的影响Fig.1 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on the growth curve of Staphylococcus aureus

3.3 对超微结构的影响 由图2可知，正常金黄色葡萄球菌细胞结构完整，胞膜、胞壁、胞质及其内含物和核质体结构清晰，位于细胞的中央。在0.26 mg/mL的广藿香精油作用下，细胞结构完整性受到破坏，胞膜损伤，胞质内含物及其核质体被溶解，溶解物渗漏出胞外，后期细胞空化死亡。

3.4 对细胞壁透性的影响 由图3可知，广藿香精油作用于金黄色葡萄球菌后，细菌胞外可检测到的碱性磷酸酶活性明显增加，且与剂量成正相关，表明广藿香精油可导致金黄色葡萄球菌细胞壁透性的变化。

3.5 对细胞壁肽聚糖量 (以对应OD值表示)的影响 由图4可知，金黄色葡萄球菌细胞壁的重要组成成分肽聚糖对应OD值在不同质量浓度的广藿香精油作用下，在检测时间2 min以内，无明显变化，说明细胞壁肽聚糖的量变化不大。

图2 广藿香精油对金黄色葡萄球菌超微结构的影响Fig.2 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on the ultrastructure of Staphylococcus aureus

图3 广藿香精油对金黄色葡萄球菌碱性磷酸酶活性的影响Fig.3 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on the activity of Staphylococcus aureus extracellular alkaline phosphatase

3.6 对细菌胞内钾、镁离子渗漏的测定 由图5可知，广藿香精油可使金黄色葡萄球菌菌液中的K+、Mg2+可检出量明显增加，且呈明显的量效关系;表明广藿香精油可导致金黄色葡萄球菌胞内的K+、Mg2+出现渗漏。

图4 广藿香精油对细胞壁肽聚糖量的影响Fig.4 Impact of drugs on the content of peptidoglycan

3.7 对膜蛋白构象的影响 将金黄色葡萄球菌膜蛋白上 Phe，Tyr和 Trp的发射波长分别固定在282 nm、303 nm和348 nm，使用酶标仪扫描，得知Phe的激发波长是286 nm，Tyr的激发波长是297 nm，Trp的激发波长是342 nm。

图5 广藿香精油对金黄色葡萄球菌K+、Mg2+渗漏的影响Fig.5 Determination of essential oil from Pogostemon cablin on Staphylococcus aureus intracellular potassium ion and magnesium ion leakage

通过在菌液中添加碘化钾溶液发现，低浓度的碘化钾就能使金黄色葡萄球菌的Trp和Tyr残基的荧光强度受到淬灭的影响，可以推断出Trp和Tyr残基位于细胞膜外;而高浓度的碘化钾才可使金黄色葡萄球菌Phe残基的荧光强度受到影响，同时荧光强度是逐渐降低的，可以推断出Phe残基位于细胞膜内，当膜结构发生变化时，位于膜内部的Phe残基暴露出来并与碘化钾结合。因此，选择Phe残基来研究广藿香精油与金黄色葡萄球菌膜蛋白的相互作用。

从图6可知，广藿香精油可淬灭金黄色葡萄球菌Phe残基的荧光强度，且随着广藿香精油浓度的增加，Phe残基的荧光强度相应的下降。由此表明广藿香精油可导致金黄色葡萄球菌膜蛋白构象改变。

4 讨论

图6 广藿香精油对金黄色葡萄球菌Phe残基的影响Fig.6 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on Staphylococcus aureus Phe

近年来植物精油的抑菌活性屡见报道，如马缨丹精油对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌的 MICs为350 ～400 mg/mL［17］，Seseli rigidum 精油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌等常见病原菌 MICs为6.25～25 mg/mL［18］。本研究结果发现广藿香精油在体外有很强抑菌活性，不仅对金黄色葡萄球菌敏感菌有很强的抑菌效力，而且对金黄色葡萄球菌的耐药菌MRSA亦有很强的抑菌活性，且MICs均为0.51 mg/mL，实验结果与现有文献报道一致［19-20］。生长曲线法不仅可以揭示药物的抑菌效力，且可通过微生物的生长曲线反映群体的生长规律，并从中知晓药物对微生物产生的效果以及时间药效的变化情况等多种的信息［21］。本研究采用该法发现，广藿香精油可抑制细菌的生长，与体外试验结果一致，并可延长细菌生长延迟期。

细菌主要由细胞壁、细胞膜、核质体、细胞质等构成。细胞膜是由蛋白质、脂类等组成的超分子体系，与细胞的能量转换、物质运送、信息识别与传递等生命活动均密切相关。细菌的细胞壁有协助细胞运动和生长、提高机械强度、保持细胞外形、抑制机械损伤、介导细胞间的相互作用、防止大分子入侵等生理功能。精油的抑菌靶点有细胞壁、细胞膜等［22-24］。通过广藿香精油对金黄色葡萄球菌的超微结构的研究表明广藿香精油可导致金黄色葡萄球菌的结构完整性和胞膜受损，细菌的胞浆内容物渗漏。肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成成分之一;碱性磷酸酶是存在于金黄色葡萄球菌细胞壁、膜之间的一种酶，正常情况下，在胞外不能检测到其活性。但当细胞壁受到破坏而导致透性增加，则其将泄漏到胞外［25］。通过研究广藿香精油对细胞壁透性和肽聚糖量的影响，结果表明广藿香精油可明显增加金黄色葡萄球菌细胞壁透性，但在检测时间内对受试细菌的细胞壁肽聚糖的量无明显影响。

膜蛋白是镶嵌于膜脂的一类结构独特的蛋白质，可介导细胞和外界之间信号的传导，并执行许多基本以及重要的细胞生物学功能，如构成了离子跨膜的通道［26］，构成转运蛋白［27］等。Mg2+、K+维持是细菌正常生命活动不可或缺的金属离子［28］，同时也是维持细胞渗透压平衡的重要盐类物质。细菌胞内的K+、Mg2+一般是不会同时大量的渗出胞膜的，若Mg2+、K+大量泄漏到细胞外，表明细胞膜受到了损伤［29］。通过研究广藿香精油对金黄色葡萄球菌膜蛋白构象和离子渗漏的影响，结果表明广藿香精油可导致金黄色葡萄球菌膜蛋白构象的变化，胞内的K+、Mg2+大量渗出，该实验结果与电镜结果相一致。综上所述，以上实验结果相互印证了广藿香精油对金黄色葡萄球菌的抑菌机制与影响细胞膜有关。

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