周 耀魏 威陈春悦叶 杨

1浙江省奉化市中医医院 奉化 315500 2浙江省中西医结合医院

颈椎后纵韧带骨化症与BMP-2、BMP-4基因多态性的关联性研究

周 耀1魏 威2陈春悦2叶 杨2

1浙江省奉化市中医医院 奉化 315500 2浙江省中西医结合医院

目的探讨颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）与BMP-2基因第3外显子的rs79417223和BMP-4基因第4外显子的rs147822607两个SNP位点的相关性。方法选取47例浙江地区汉族颈椎后纵韧带骨化症患者，以100名正常个体作为对照组，采用PCR+Sanger DNA测序，统计分析2个位点基因型的分布信息。结果BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A患者、BMP-4第4外显子的rs147822607A→C患者与正常组呈现明显差异（P＜0.05，P＜0.01）。结论BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A、BMP-4基因、第4外显子的rs147822607A→C，这2个多态性位点与OPLL的发病具有强烈相关性。

颈椎后纵韧带骨化症；单核苷酸多态性；易感基因；BMP-2基因；BMP-4基因

颈椎后纵韧带骨化症（ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL）属于一种骨成形病，表现为颈椎后纵韧带内异位骨的形成，主要压迫脊髓产生临床症状以及病理损害。OPLL为一种遗传因素和环境因素共同作用所致的复杂疾病（多基因疾病）[1-6]，高发于日本人以及亚洲人。通过检索国内外相关文献，我们选取2个可疑的OPLL易感基因多态性SNP位点，BMP-2基因第 3外显子的 rs79417223和BMP-4基因第4外显子的rs147822607，进行多态性分析，以期获得这2个多态性位点与浙江地区汉族OPLL患者发病之间的关联性。

1 资料与方法

1.1临床资料 2010年7月—2013年9月就诊于浙江省奉化市中医院、浙江省中西医结合医院、解放军一一七医院等骨科的汉族OPLL患者47例，男30例，女17例，平均年龄（45.4±11.2）岁，病程0.3～8年，平均（4.1±1.2）年。根据颈部CT或者MRI明确诊断[7]。患者籍贯均在浙江地区。同时，以100名无血缘关系的浙江地区汉族正常个体作为对照组，男50名，女50名，平均年龄（43.1±7.3）岁。每位参与者均签署书面知情同意书。

1.2方 法 ①DNA制备：入组者均在无菌环境下抽取外周血10mL（EDTA抗凝）。用外周血DNA纯化试剂盒（德国Qiagen公司）提取和纯化基因组DNA。②PCR引物的合成：参考NCBI等人类基因组SNP数据库，用Primer Premier 5.0软件设计2个基因SNP位点的PCR引物序列。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1。③DNA测序分型对各多态性SNP位点分别进行PCR扩增，通过Sanger DNA测序进行基因分型。PCR产物的DNA测序委托上海生工生物工程公司进行。根据基因分型结果，计算基因型频率和等位基因频率。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，采用χ2检验，P＜0.05，表示具有统计学意义。

2 结 果

2个多态性SNP位点的基因型分布经χ2检验，符合Hardy-Weinberg遗传平衡[8]。BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A患者与正常组呈现明显差异（P＜0.05）。BMP-4第4外显子的rs147822607A→C患者与正常组呈现明显差异（P＜0.01）。各等位基因在患者组与正常对照组中的分布和分析结果，见表2。

表2 两组rs79417223和rs147822607分布及比较 例

3 讨论

OPLL是一种高发于日本人以及亚洲人的常见病。日本人的发病率约为1.9%～4.3%，韩国人约为3.6%，我国台湾省约为2.8%，我国北方人群的OPLL发病率约为0.44%～8.92%，而北美白人仅为0.12%[1-3]。OPLL是引起脊髓病的重要原因，大部分可保持长期稳定状态，起病隐匿，进展缓慢，呈现恶性发展趋势，可引起脊髓不可逆性损害，其中部分患者的脊髓功能出现急剧恶化[1]。OPLL的致瘫风险显著高于其他颈椎退行性疾病，其原因包括缺乏有效的早期筛选方法和诊断方法，自然史不明，无法确定手术时机，术后骨化物持续生长等。目前，临床上尚无有效的方法延缓和改善OPLL的骨化过程，手术疗法仍然是最主要的治疗手段，但风险系数较高[1]。1989年，Terayama等发现，日本OPLL家系中先证者亲属的发病率显著高于普通人群[4]。在北美OPLL患者中，尽管大部分病例为散发性，但仍可见部分病例具有家族聚集性[5]。目前已经达成共识，OPLL是一种严重危害人体健康的复杂性多基因遗传病，其发病机制不详，迄今没有可靠的生物学识别指标[1-2]。许多学者已做了大量的医学研究来揭示OPLL发病的分子医学基础[9]。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）为多功能蛋白，具有独特的骨形成作用和其他形态发生过程。BMP-2基因定位于20p12，而BMP-4基因位于14q22-q23。Kawaguchi等[10]曾发现某例OPLL患者术后标本中的BMP-2仅表达于骨质化的基质、软骨细胞以及邻近OPLL软骨的成纤维细胞中，而不在未骨质化的颈椎后纵韧带中表达。Kon等[11]对从OPLL和非OPLL患者的脊柱韧带中分离到的成纤维细胞进行体外培养后，也发现BMP-2优先诱导OPLL患者的成纤维细胞的成骨分化。Wang等[12]对192例汉族OPLL患者和304名健康对照的研究表明，具有BMP-2基因第3外显子SNP TC和CC基因型的男性更易罹患OPLL。Karasugi等[2]最新的一项对214例日本OPLL患病同胞对的大规模全基因组连锁分析研究显示，OPLL最有可能的易感基因区域位于20p12的微卫星标记D20S894附近（NPL= 3.43，P=0.000，27）。而Furushima等[13]对126例日本OPLL患病同胞对进行了的大规模候选基因筛查发现，仅BMP-4基因与OPLL显著关联（NPL=2.230，P=0.035）。本研究分别选取了BMP-2第3外显子的rs79417223和BMP-4第4外显子的rs147822607两个SNP位点进行分析，研究结果发现BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A患者与正常组呈现明显差异（P＜0.05）。BMP-4第4外显子的rs147822607A→C患者与正常组呈现明显差异（P＜0.01）。本研究提示BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A、BMP-4基因第4外显子的rs147822607A→C，这2个多态性位点与OPLL的发病具有强烈相关性。

由于取材等方面的原因，目前直接在人颈椎后纵韧带组织细胞水平上探讨OPLL的易感基因表达水平还比较困难，加之该病呈复杂性多基因遗传方式，并表现出强烈的遗传异质性和表型异质性，因而尚无法准确地确定致病基因，并阐释易感基因的基因-基因、基因-环境之间的相互作用及其在OPLL发病中的地位[1-3，9]。因此，对大样本患者群体进行可疑易感基因的SNP分型，寻找和鉴定相关的致病基因，是切实可行的研究方法之一。由于受时间、地点限制，本研究只收集到了47例浙江地区汉族OPLL患者，选择了2个基因多态性SNP位点进行了初步研究。研究结果提示此位点与OPLL的发病具有强烈相关性。但本研究的患者均来自于中国浙江地区，而且研究的样本数又相对偏小，所以研究结果与以前文献报道可能会存在有一些差异。在今后的研究中，可以将样本再扩大化，并且运用目前先进的外显子捕获二代测序技术运用于OPLL基因外显子组水平的分析研究，以获得OPLL发生的分子遗传学基础[9]。

［1］Saetia K，Cho D，Lee S，et al.Ossification of the posterior longitudinal ligament:a review［J］.Neurosurg Focus，2011，30（3）：E1.

［2］Karasugi T，Nakajima M，Ikari K，et al.A genome-wide sibpair linkage analysis of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.J Bone Miner Metab，2013，31（2）：136-143.

［3］魏威，张永华，石仕元.颈椎后纵韧带骨化症的易感基因研究现状［J］.中国优生与遗传杂志，2010，18（4）：11-13.

［4］Terayama K.Genetic studies on ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.Spine，1989，14（11）：1184-1191.

［5］Tanabe J，Sarin H，Kindt G.Familial ossification of the posterior longitudinal ligament（OPLL）in the thoracic spine：Case report［J］.Surg Neurol，2002，58（6）：403-405.

［6］Washio M，Kobashi G，Okamoto K，et al.Sleeping habit and other life styles in the prime of life and risk for ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine（OPLL）：Acase-control study in Japan［J］.J Epidemiol，2004，14（5）：168-173.

［7］Tsuyama N.Ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.Clin Orthop Relat Res，1984，18（4）：71-84.

［8］Guo SW，Thompson E.Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles［J］.Biometrics，1992，48：361-372.

［9］Wei W，He HL，Chen CY，et al.Whole exome sequencing implicates PTCH1 and COL17A1 genes in ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine in Chinese patients［J］.Genet Mol Res，2014，（in press）.

［10］Kawaguchi H，Kurokawa T，Hoshino Y，et al.Immunohistochemical demonstration of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-β in the ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine［J］. Spine，1992，17（Suppl 3）：S33-S36.

［11］Kon T，Yamazaki M，Tagawa M，et al.Bone morphogenetic protein-2 stimulates differentiation of cultured spinal ligament cells from patients with ossification of the posterior longitudinal ligament［J］.Calcif Tissue Int，1997，60（3）：291-296.

［12］Wang H，Yang ZH，Liu DM，et al.Association between two polymorphisms of the bone morpho-genetic protein-2 gene with genetic susceptibility to ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine and its severity［J］.Chin Med J，2008，121（18）：1806-1810.

［13］Furushima K，Shimo-Onoda K，Maeda S，et al.Large-scale screening for candidate genes of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.J Bone Miner Res，2002，17（1）：128-137.

Relationship Between the Gene Polymorphisms of BMP-2 and BMP-4 with Ossification of Posterior Longitudinal Ligament of the Spine in a Chinese population

ZHOU Yao1,WEI Wei2,CHEN Chunyue2,YE Yang2. 1 Fenghua Chinese Medical Hospital of Zhejiang Province,Fenghua(315500),China;2 Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo explore the relationship between 2 single nucleotide polymorphisms（SNPs）of BMP-2 and BMP-4 and ossification of posterior longitudinal ligament of the spine（OPLL）in a Chinese population.MethodsForty-seven sporadic OPLL patients and 100 healthy controls in Zhejiang area were recruited for association analysis.The SNP regions of BMP-2 and BMP-4 genes were amplified by PCR and Sanger sequencing.Genotype frequencies of the SNPs were compared between the cases and control subjects with SPSS 13.0 software.ResultsBoth Of the rs79417223 G→A site in the exon 3 of BMP-2 and the rs147822607 A→C site in the exon 4 of BMP-4，the patient and normal control groups showed significant differences（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionsThe rs79417223 and rs147822607 have a strong correlation to OPLL.

ossification of posterior longitudinal ligament；single nucleotide polymorphism；susceptibility gene；BMP-2 gene；BMP-4 gene

2013-12-01

浙江省医药卫生科技计划项目（No.2010KY168），浙江省宁波市科技计划项目（No.2013C50023）

叶杨，E-mail：dagou1234@163.com