羿丽杰，姜 宇，詹佳硕，闵钟熳*

（1.沈阳师范大学粮食学院，辽宁 沈阳 110034；2.环境保护部核与辐射安全中心，北京 100082）

近年来，随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌对人类健康造成极大危害，乳酸菌代谢产生的细菌素因具有抑菌、天然、安全的特性，而成为近年来研究的热点。目前食品中使用的细菌素多为Ⅰ类细菌素，但是大多数乳酸菌菌株产生的细菌素抑菌谱较窄，且通常对引起食品腐败的革兰氏阴性菌不具有抑制作用，产生的量较少，且有些细菌素由质粒编码，产量不稳定，理化性质也不是很好。而本实验所要研究的肠球菌素E3是属于Ⅱ类乳酸菌细菌素，对大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和米曲霉具有抑制作用，而且它耐高温，具有热稳定性[1]，因此是最有希望成为天然食品防腐剂的新型食品添加剂。

本试验以东北传统发酵酸菜中分离出的一株产细菌素的屎肠球菌菌株BC-3为研究对象，对其产生肠球菌素E3的发酵条件进行优化[2]，并对肠球菌素E3的生物学性质进行了研究[3]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验菌：屎肠球菌（Enterococcus faecium）BC-3 分离自北方传统发酵酸菜；指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）实验室保存。

培养基[4]采用MRS培养基，溶菌肉汤（lysogeny broth，LB）培养基。

1.2 仪器与设备

SW-CJ型超净工作台：上海爱明仪器有限公司；pH计：Thermo（MODEL868）美国科峻仪器公司；YXQ型电热高压蒸汽灭菌锅：上海医用核子仪器厂；DHP-781恒温培养箱：日本爱朗；Kendor离心机：美国科峻仪器公司；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抑菌效果测定

采用滤纸片法[5-6]，测量抑菌直径，取3次试验的平均值。其中抑菌圈直径包括滤纸直径（6 mm）。

1.3.2 单因素试验[7-8]

发酵时间的影响：保持试验过程中其他条件不变，发酵的时间为16 h、20 h、24 h、28 h，测定发酵液的抑菌圈直径。

温度的影响：保持试验过程中其他条件不变，温度为35 ℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃，培养20 h，测定发酵液的抑菌圈直径。

pH值的影响：保持试验过程中其他条件不变，pH值为5、6、7、8，培养20 h，测定发酵液的抑菌圈直径。

接种量的影响：保持试验过程中其他条件不变，接种量为1%、2%、3%、4%，培养20 h，测定发酵液的抑菌圈直径。

1.3.3 正交试验选择初发酵最佳的条件

为了进一步确定最佳发酵条件，取4个影响因素：发酵时间、pH、接种量、温度分别为A、B、C、D，各3个水平，制定因素水平见表1。

表1 发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization

1.3.4 肠球菌素生物学性质的研究

（1）硫酸铵盐析[9-10]

屎肠球菌BC-3发酵液经12 000 r/min、4 ℃低温离心10 min，取上清液弃菌体沉淀。取上清液用硫酸铵粉末进行盐析，盐析液装于截留分子质量为3 500 ku的透析袋中对去离子水透析脱盐，用BaCl2跟踪检测去离子水中的硫酸根离子，没有白色沉淀出现则透析完毕。透析后用液体用PEG20000浓缩至透析前体积，存放于4 ℃冰箱中待用。

（2）温度对肠球菌素E3稳定性的影响

分别取等量的肠球菌素E3于EP管中，在60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃条件下水浴加热10 min、20 min，然后测定其对肠球菌素E3稳定性的影响。

（3）pH值对肠球菌素E3稳定性的影响

取等量的肠球菌素E3于EP管中，分别调pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，测定其对肠球菌素E3稳定性的影响。

（4）蛋白酶对肠球菌素E3稳定性的影响

取等量的肠球菌素E3于5个EP管中，然后分别向试管中加入等量胃蛋白酶、胰蛋白酶，木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，空白，然后观察抑菌活性。

（5）有机溶剂对肠球菌素E3稳定性的影响

取等量的肠球菌素E3于EP管中，分别加入乙醇、丙酮、乙醚、异丙醇，同体积原液为对照，测量抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间的影响

不同发酵时间对屎肠球菌BC-3产肠球菌素E3的影响见图1。

图1 发酵时间对肠球菌素E3产量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on enterococcin E3 yield

由图1可知，发酵时间对抑菌活性影响较大，肠球菌素E3产量随发酵时间的延长而先增后降，当发酵时间为20 h时，抑菌活性达到最大，抑菌圈直径为16.34 mm。

2.1.2 温度的影响

不同的温度对屎肠球菌BC-3产肠球菌素E3的影响见图2。

图2 温度对肠球菌素E3产量的影响Fig.2 Effect of temperature on enterococcin E3 yield

由图2可知，温度对抑菌活性影响较大，肠球菌素E3产量随温度升高而先增后降，在温度为37 ℃时，抑菌活性达到最大，抑菌圈直径达到最大为16.33 mm。

2.1.3 pH值的影响

不同的pH值对屎肠球菌BC-3产肠球菌素E3影响见图3。

图3 pH值对肠球菌素E3产量的影响Fig.3 Effect of pH on enterococcin E3 yield

由图3可知，肠球菌素E3产量随pH的变化不是很明显，随pH增加抑菌活性先增后降，当pH值为6时，抑菌活性达到最大，此时抑菌圈直径为16.24 mm。

2.1.4 接种量的影响

不同的接种量对屎肠球菌BC-3产肠球菌素E3的影响见图4。

图4 接种量对肠球菌素E3产量的影响Fig.4 Effect of inoculum on enterococcin E3 yield

由图4可知，肠球菌素E3产量随接种量的增加而先增后降，当接种量为2%时，抑菌活性达到最大，此时抑菌圈的直径为16.66 mm。

2.2 发酵条件优化正交试验

通过单因素试验确定，最佳温度为37 ℃，最佳pH值为6，最佳接种量为2%，最佳发酵时间为20 h，为了进一步确定最佳发酵条件的组合，取4种影响因素：发酵时间、pH值、接种量、温度，各因素取3个水平，采用L9（34）正交试验设计[3]。正交试验结果见表2。

通过极差分析表明，各因素的主次影响顺序为：发酵时间＞温度＞pH＞接种量，这表明发酵时间对屎肠球菌产肠球菌素E3量的影响最大，确定了屎肠球菌BC-3产肠球菌素E3的最佳发酵条件组合为A2B3C1D2。即在发酵时间为20 h、pH值为6.5、接种量为1.5%、温度为37.0 ℃时抑菌效果最强，在此条件下的抑菌圈直径为17.87 mm。

表2 发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization

2.3 肠球菌素的生物学特性

2.3.1 温度和时间对肠球菌素E3稳定性的影响

经过硫酸铵盐析后，得到肠球菌素E3粗提液，对其在不同温度下的抑菌圈直径进行测量，研究温度和时间对肠球菌素E3稳定性影响，结果见表3。

表3 温度和时间对肠球菌素E3稳定性的影响Table 3 Effect of temperature and time on enterococcin E3 stability

由表3可知，道肠球菌素E3热稳定性较高，在120 ℃水浴加热处理15 min后，抑菌活性仍能达到90%左右。

2.3.2 pH值对肠球菌素E3稳定性的影响

经过硫酸铵盐析后，得到肠球菌素粗提液，对其在不同pH值下的抑菌圈直径进行测量，研究pH值对肠球菌素E3稳定性影响，结果见表4。

表4 pH对肠球菌素E3稳定性的影响Table 4 Effect of pH on enterococcin E3 stability

由表4可知，肠球菌素E3在pH值2.0～10.0的范围内仍具有抑菌活性，且抑菌活性的变化不是很大，这说明pH值对肠球菌素E3稳定性几乎没有影响。

2.3.3 蛋白酶对肠球菌素E3稳定性的影响

经过硫酸铵盐析后，得到肠球菌素E3粗提液，对其在经不同蛋白酶处理下的抑菌圈直径进行测量，研究蛋白酶对肠球菌素E3稳定性影响，结果见表5。

表5 蛋白酶对肠球菌素E3稳定性的影响Table 5 Effect of protease on enterococcin E3 stability

由表5可知，肠球菌素E3经各蛋白酶的作用，能够完全失活，可确定这种抑菌活性的物质为蛋白质[11]，而且可被蛋白酶降解不会在机体内残留，具有较高的安全性[12]，这与岳喜庆等[13]曾经的报道相似。

2.3.4 有机溶剂对肠球菌素E3稳定性的影响

经过硫酸铵盐析后，得到肠球菌素E3粗提液，对其在不同有机溶剂处理下的抑菌圈直径进行测量，研究有机溶剂对肠球菌素E3稳定性影响，结果见表6。

表6 有机溶剂对肠球菌素E3稳定性的影响Table 6 Effect of organic solvents on enterococcin E3 stability

由表6可知，肠球菌素E3经有机溶剂作用后仍具有抑菌活性，因此有机溶剂作用对肠球菌素E3的影响不是很大，证明其化学性质比较稳定。

3 结论

为提高肠球菌素E3的产量，进行单因素试验和正交试验，得到在发酵时间为20 h、pH值为6.5、接种量为1.5%、温度为37.0 ℃时抑菌活性最高，此时抑菌直径为17.87 mm。对肠球菌素E3的生物学特性试验分析得到，肠球菌素E3具有耐热性，在pH为2.0～10.0的范围内稳定性较好，可以被蛋白酶完全降解，安全性高，有机溶液处理后其稳定性几乎不受影响。说明肠球菌素E3在食品防腐中具有很好的应用前景[14-15]，值得进一步深入研究。

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