黄贤刚，管 斌 *，鲁 曾，胡晓文

（1.日照职业技术学院 海洋工程学院，山东 日照 276826；2.中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

黑木耳（Auricularia auricula）是一种药食两用大型真菌，富含胶质、磷脂和纤维素，具有润肺、清肠等功能，其中的黑木耳多糖成分具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症、降血糖、抗辐射等生理功能，具有极大的开发利用价值[1]。苹果醋是以苹果为主要原料，经酒精发酵和醋酸发酵而成，含有丰富的有机酸，开胃、促消化，能抑制体内氧化物的形成，具有抗疲劳、抗衰老等生理功用[2]。利用液体深层发酵后的黑木耳菌丝体和压榨得到的苹果汁，共同进行酒精发酵和醋酸发酵，再通过口味调配加工而成的黑木耳苹果醋饮料，既最大限度地促进黑木耳和苹果的合理开发利用，又集两者的滋补功效和营养价值于一体，具有广阔的市场前景[3-4]。本研究以浓缩苹果汁和黑木耳菌丝体为原料，探讨确定黑木耳苹果醋饮料酒精发酵过程的工艺参数，通过单因素试验对初始糖度、发酵温度、pH值、酵母接种量等做出初步判断，然后通过Box-Behnken试验设计得到回归模型并预测最大值，利用模型优化得到各因素共同作用下的最佳工艺条件并通过试验验证，为黑木耳苹果醋饮料酒精发酵试验及中试生产提供参考数据[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓缩苹果汁（可溶性固形物70.0%～72.0%，酸度0.7%，pH 3.6～4.4）、斜面培养基（2%琼脂，麦芽汁10°Bx，pH6.4）：日照职业技术学院食品工程技术中心提供；酵母（BM45）：日照职业技术学院食品研究所提供；发酵的原料液：破壁匀浆的菌丝体与两倍稀释灭菌的浓缩苹果汁以重量比9∶1混匀；白砂糖：市售；酵母浸膏（BR）：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂（食品级）：东海琼胶食品有限公司；葡萄糖（分析纯）、柠檬酸（分析纯）：上海埃彼化学试剂有限公司；乙醇（分析纯）：天津登科化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备[6，9]

GHP-9080隔水恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；202-2A鼓风干燥箱：龙口先科仪器公司；YXQ-LS-50全自动高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；AR2140电子天平：美国奥豪斯公司；PHS-3C酸度计：上海雷磁仪器厂；7890A气相色谱仪：配有FID检测器自动进样器，色谱柱HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.5 μm），安捷伦科技有限公司；糖度计：北科新宇公司；ZHWY-2102恒温振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；磁力搅拌器：龙口先科仪器公司；SP-721E可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程[7]

1.3.2 初始糖度单因素试验

分别将发酵原液初始糖度调至8°Bx、10 °Bx、12°Bx、14°Bx、16°Bx、18°Bx 6个梯度，再接入5%已活化的酵母液进行发酵，温度控制在28 ℃，直到发酵过程停止。期间固定间隔时间测定发酵完毕后的酒精度和残余糖度。

1.3.3 发酵温度单因素试验

原液中接入5%已活化的酵母液，置入培养箱中发酵，温度分别控制在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃5个梯度，直至酒精度上升缓慢，发酵停止。期间固定间隔时间测定发酵液的酒精度和残余糖度。

1.3.4 pH单因素试验

将调糖配置的发酵原液的pH值分别控制在3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接入5%已活化的酵母液，置入培养箱中发酵，温度控制在28 ℃，直至酒精度上升缓慢，发酵过程停止。期间定时测定发酵液的酒精度和残余糖度。

1.3.5 接种量单因素试验

分别向处理好的发酵原液中接入3%、4%、5%、6%、7%、8%已活化的酵母菌，置入培养箱发酵，温度控制在28 ℃，直至酒精度上升缓慢，发酵活动停止。期间定时测定发酵液的酒精度和残余糖度。

1.3.6 Box-Behnken试验设计[8，12]

在单因素试验结果基础上，选择初始糖度、发酵温度、pH值、接种量4个因素，以酒精度（Y）为指标，利用Box-Behnken法，选取三个水平进行优化研究，建立数学模型进行3次平行试验，进一步探求各因素共同作用下的最佳发酵条件。因素与水平编码表见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3.7 酒精发酵动态曲线

根据得到的最佳工艺参数，在28 ℃、pH值5.0条件下，将6%的酵母菌接入到初始糖度14.5°Bx的原料液中发酵，至残余糖度和酒精度变化均不再明显时结束。定时测定残余糖度、酒精度变化情况。

1.3.8 测定方法

酒精度测定[9]：色谱法，柱温50 ℃，气化室和检测器温度240 ℃，载气（高纯氮）流量30 mL/min，氢气流量30 mL/min，空气流量：300 mL/min；可溶性固形物测定：糖度计；总糖测定：GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.9 数据处理方法

单因素试验通过3平行试验取平均值。根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.05软件设计4因素3平分析试验，并对结果数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 初始糖度对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响[8]

图1 初始糖度对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol fermentation

初始糖度对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响见图1。由图1分析可知，随着初始糖度的递增，发酵完毕后料液中的酒精度呈上升趋势。其主要原因是初始糖度较低时，可供酵母菌利用的糖分较少，不利于酒精发酵的进行；随着初始糖度的增加，同等条件下酒精发酵作用进行明显；初始糖度达到14°Bx以上时，发酵完毕后的酒精度增加无明显变化，残余糖度逐渐增多，这主要是因为发酵液中不断增高的酒精度对酵母菌生长有所抑制，初始投入的糖原料不能充分利用。因此，初始糖度以14°Bx较适宜。

2.2 发酵温度对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响

发酵温度对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响见图2。由图2分析可知，酒精度随着温度的升高不断增大，28 ℃时酒精度最大，酒精发酵效果较好，这说明温度影响酵母菌的细胞活力；超过28 ℃后，随着温度的升高，酒精度逐渐下降，这一方面可能是由于温度过高抑制了酵母菌的生长繁殖，另一方面可能由于温度的升高造成部分酒精的挥发，从而使得酒精度值变小。因此，选择28 ℃发酵温度较适宜。

图2 发酵温度对酒精发酵的影响Fig.2 Effect of temperature on alcohol fermentation

2.3 pH值对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响

图3 pH值对酒精发酵的影响Fig.3 Effect of pH on alcohol fermentation

pH值对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响见图3。从图3可以看出，当pH值为3.5～5.0时，酒精度不断增加且迅速，pH值为5.0时酒精度达到最大；当pH值＞5.0后，发酵液的酒精度呈下降趋势。这说明酵母菌的酒精发酵作用受到溶液酸碱度的影响，在发酵过程中，发酵液的pH值会随着微生物的生长和代谢而不断变化，可能会偏离酵母菌适宜生长或者产物累积的pH值。因此，pH值初定在5.0。

2.4 接种量对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响

图4 接种量对酒精发酵的影响Fig.4 Effect of inoculum on alcohol fermentation

接种量对黑木耳苹果醋饮料酒精发酵的影响见图4。由图4分析可知，酵母菌接种量为5%时，酒精度达到最大。其中原因主要是由于接种量过小造成了酵母菌自身繁殖消耗过多，而用于发酵的消耗较少；接种量超过一定值也会增加酵母菌用于生长的消耗，从而造成酒精度的下降。

2.5 Box-Behnken试验设计

按照响应面设计方案，安排了29组试验组合，每组3次平行试验发酵结束时分别测定其酒精度取平均值[10]，结果见表2。

表2 Box-Behnken试验结果与分析Table 2 Result and analysis of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert 8.05软件，以酒精度为响应值，对表2进行多元回归拟合，得到工艺参数初步回归模型：

模型的方差分析结果如表3所示。

表3 Box-Behnken试验方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiment

从表3可知，模型（1）的F值为39.92，P值＜0.000 1，说明该模型具有高度显著性，模型拟合度较好，能对酒精度进行分析和预测；失拟项P=0.131 8＞0.05，影响不显著，表明回归模型与实测值能较好地拟合，可以用此模型对黑木耳苹果醋酒精发酵阶段的酒精度进行分析和预测。

由回归方程各变量的系数显著性检验可知，模型的一次项A、C、D影响极显著（P＜0.01），B影响不显著（P＞0.05）；二次项A2、B2、C2、D2影响均极显著（P＜0.01）；交互项AD影响极显著（P＜0.01），BC影响显著（P＜0.05），AB、AC、BD、CD影响不显著（P＞0.05）。依据方程各变量系数的大小可知，初始糖度、接种量对酒精度影响最大，其次pH值，最后是发酵温度。

剔除不显著项，经优化后回归模型为：

对回归方程（2）进行方差分析，结果表明，模型各项检测数据均达到理想指标，其中决定系数R2为0.966 2，说明96%的试验数据可用这个方程解释[11-12]。

2.6 响应面分析

在交互项中，初始糖度（A）和接种量（D）的交互作用影响极显著，发酵温度（B）和pH值（C）的交互作用影响显著[13]。利用Design-Expert 8.05软件绘出两者相应的响应面图和等高线图[14]，如图5、图6所示。

图5 初始糖度(A)和接种量(D)的交互作用对酒精度影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction effect between initial sugar content (A) and inoculum (D) on alcohol content in fermentation

图6 发酵温度(B)和pH值(C)的交互作用对酒精度影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface and contour plots of the interaction effect between temperature (B) and pH(C) on alcohol contect in fermentation

从图5可知，在发酵温度28 ℃、pH值为5.0情况下，当初始糖度较低时，酒精度随着初始糖度的增加而不断上升，但当初始糖度超过14°Bx后，酒精度随着初始糖度的增加而降低，酒精度呈抛物线变化。接种量在初始糖度较低时，对酒精度的影响不大，随着初始糖度的增加，对酒精度的影响逐渐明显，但当初始糖度超过14°Bx后，对酒精度的影响又趋于平缓。这主要是接种量过小时酵母菌自身消耗多，过多时也会增加自身用于生长的消耗，和单因素试验结果吻合。在初始糖度13～15°Bx和接种量4%～6%范围内，酒精度可以达到试验最大值。

由图6可知，在初始糖度14°Bx、接种量5%的情况下，随着发酵温度的升高，酒精度呈抛物线状态。pH值则在较低和较高时，对酒精度的影响不明显，这主要因为发酵液的pH值会随着微生物的生长和代谢而不断变化，对酒精度的生成有所影响。在发酵温度27～29 ℃和pH 4.5～5.5范围内，酒精度可以达到试验最大值。

在试验结果分析及模型拟合的基础上，利用软件分析计算得到回归方程的最大值，即在初始糖度14.42°Bx、发酵温度28.01 ℃、pH值5.13、接种量6%时，预测最大值为6.72%vol。根据试验条件和实际操作方便性，将工艺条件修正为初始糖度14.5 °Bx、发酵温度28 ℃、pH值5.0、接种量6%时，发酵7 d，进行3次平行试验验证，得到的酒精度平均值为6.63%vol，接近预测值，说明模型较为准确，对于黑木耳苹果醋酒精发酵条件的研究具有指导意义[15]。

2.7 黑木耳苹果醋酒精发酵的动态曲线

将得到的试验结果绘制成曲线，见图7。

图7 酒精发酵动态变化曲线Fig.7 Dynamic curve of alcohol fermentation

从图7可知，在整个发酵过程中，残余糖度随时间的延续不断下降，而酒精度则呈上升趋势[16]。前2天，糖度持续下降，但酒精度的变化趋势稍缓慢，这主要是发酵初期，酵母菌仍处于有氧期，菌体繁殖较快但发酵作用较缓慢；第3天，发酵作用逐渐增强，伴随产生大量气泡，酒精味道变得愈来愈浓重，这段时间为发酵主要时期，温度、pH值等条件适宜，酵母菌处于无氧条件，发酵作用持续增强，酒精度上升明显，残余糖度快速下降；第6天后，酒精度和残余糖度的变化趋于平缓，不断有产物沉淀，酒精含量累积到最大，糖的消耗量降至最低，此时由于发酵液中一些酵母菌菌体代谢消耗，加上较高浓度的酒精对酵母的生长发酵活动的抑制作用，发酵过程趋于缓和；第7天，糖分参与发酵转化过程基本完成，酒精度也基本达到最大值，不再上升，此时发酵过程结束。因此，发酵时间选择7d为宜。

3 结论

通过试验及数据分析，确定了黑木耳苹果醋酒精发酵过程的最佳工艺参数组合：初始糖度14.5°Bx，发酵温度28 ℃，pH值5.0，接种量6%，发酵时间7d，通过试验进行验证，此时的酒精度可达到6.63%vol，与预测值接近。这些参数的获取和模型的建立为黑木耳苹果醋酒精发酵的实际生产提供了参考数据，具有较强的实践指导意义。

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