孙 勇

（北京市食品研究所，北京 100162）

大豆中含有丰富的蛋白质及近20种氨基酸，其中含有人体必需氨基酸，营养丰富，不含胆固醇，与乳、肉和鸡蛋等动物蛋白相比，大豆蛋白具有较强的价格优势[1]。但大豆蛋白质分子结构复杂，相对分子质量较大，溶解性差，消化率和生物效价不及牛乳等动物蛋白质[2]。通过生物酶解可以使大豆蛋白这些性质得到改善[3]，酶解产物大豆肽比蛋白质更易于被人体消化和吸收[4]，且大豆肽具有降血脂[5]、降血压[6]、抗氧化[7]、提高机体免疫力[8]等生物活性作用，从而进一步拓展了大豆蛋白在食品工业中的应用[9]。同化学改性相比，酶法改性具有酶解条件温和、功能性质可控等优点。生物酶改性作为大豆蛋白改性的一种新兴、无毒副作用、安全的改性方式，具有很重要的研究开发意义。

近年来利用酶法对大豆蛋白的研究较多。钱方等[10-11]对蛋白酶及其大豆蛋白水解物苦味的研究，得出胃蛋白酶和Alcalase碱性内切酶较易产生苦味，并对大豆苦味肽进行了研究，得到苦味肽粗品。但采用多种酶对大豆蛋白水解液脱苦效果研究尚鲜有报道。本研究拟采用Alcalase 2.4L碱性内切酶和Flavourzyme风味蛋白酶对大豆分离蛋白的水解及脱苦的反应进行研究和条件优化，采用单因素和正交试验确定最佳酶解条件，为工业化生产功能性大豆多肽提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白：山东禹王集团；福林试剂：上海荔达生物科技有限公司；硼砂：山东黄河龙生物有限公司；三氯醋酸、碳酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；酪氨酸：国药集团化学试剂有限公司；奎宁：北京化学试剂公司；Alcalase碱性内切蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶（食用级）：丹麦诺维信公司。

1.2 仪器与设备

ES-300E电子天平、UV-6000分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DK-S24电热恒温水浴锅：北京市长风仪器仪表公司；PH/ORP-1001 pH计：上海三本环保科技有限公司；HJ-4恒温搅拌器：海门市麒麟医用仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白预处理

按一定底物浓度配比准确称取大豆分离蛋白，配成所需浓度的大豆蛋白溶液，然后在90 ℃水浴加热10 min，使蛋白质适度变性，以易于酶解的进行，取出冷却至室温，放入恒温搅拌器。

1.3.2 酶活力测定

福林酚试剂在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应[12]。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈蓝色反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。经测定Alcalase碱性内切蛋白酶活力为183 100 U/mL，Flavourzyme风味蛋白酶活力为25 600 U/g。

1.3.3 水解度的测定

蛋白质的水解度（degree of hydrolysis，DH）是指蛋白质水解反应过程中被裂解的肽键的百分数。在碱性条件下采用pH-Stat法[13]。计算公式如下：

式中：DH为水解度，%；B为消耗碱量，mL；N为NaOH 摩尔浓度，mol/L；α为大豆蛋白氨基的平均解离度，当pH值为7时，α=0.44；m为水解液中蛋白质的总质量，g；h为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，mmol/g，对于大豆分离蛋白h=7.75 mmol/g。

1.3.4 Alcalase 2.4L碱性内切酶酶解反应

1.3.4.1 单因素试验

配制一定浓度大豆蛋白混合液预处理后，随着水解的进行，酶解液pH值逐渐下降，滴加0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值为8.0，记录1 h内消耗碱量与时间关系，换算成DH值与时间关系，绘制成图，确定最佳加酶量[14]。固定其他条件，分别改变加酶量、底物浓度、温度、pH值等单一条件，考察Alcalase 2.4L碱性内切酶对大豆蛋白水解度的变化情况。加酶量条件：底物质量分数5%，酶解温度60 ℃，酶解pH 8.0，加酶量按酶和底物之比为2 000 U/g、5 000 U/g、8 000 U/g、11 000 U/g、14 000 U/g。底物质量分数条件：酶解温度60 ℃、酶解pH 8.0、加酶量10 000 U/g 条件下，底物质量分数为1%、3%、5%、7%、9%。酶解温度条件：底物质量分数5%、酶解pH8.0、加酶量10 000 U/g，酶解温度为50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃。酶解pH值条件：底物质量分数5%、酶解温度60 ℃、加酶量10 000 U/g条件下，酶解pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.4.2 Alcalase酶解条件优化正交试验

Alcalase蛋白酶酶解大豆分离蛋白的最佳条件的确定采用L9（34）正交设计，以水解度（DH）为测定指标，考察4个因素对水解度的影响，水解时间为1 h。根据最佳单因素试验结果分析，选择底物质量分数、水解温度、pH值、加酶量进行4因素3水平的正交试验。正交试验因素与水平如表1所示。

表1 Alcalase酶解条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing enzymatic hydrolysis by Alcalase

1.3.5 苦味值的测定

以奎宁为基准物质，配制标准液。经评定当奎宁标准液浓度为c=3×10-6mol/L时，刚好无苦味，定c浓度为下限，32c浓度为上限（若再增加奎宁浓度，苦味基本不再增加），在c～32c之间，随着奎宁浓度增加，苦味值也相应增加。设定苦味值的评分标准见表2[15]。

表2 苦味值的评分标准Table 2 Evaluation scores of bitterness value

评定小组由5人组成，评定员用蒸馏水漱口后，用一次性吸管取待评定液2～3 mL置于口中，10 s后吐出，漱口，取苦味程度相近的标准液品尝，确认两苦味是否相近，若相近即可将待评定液的苦味值定为该标准液的苦味值，否则需取其他标准液再尝，直至确定苦味值。结果取5人平均评定值[16]。

1.3.6 Flavourzyme风味蛋白酶酶解反应

（1）单因素试验

对经过Alcalase 2.4L碱性内切酶水解后的水解液进行4 h水解，根据苦味评分标准进行评分。固定其他条件，分别改变加酶量、温度、pH值、酶解时间等单一条件，考察Flavourzyme风味蛋白酶对大豆蛋白的水解液苦味值的变化情况。加酶量酶解pH 7，酶解温度50 ℃，酶解时间4 h，加酶量分别为100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g、300 U/g。酶解温度：酶解pH 7，加酶量250 U/g，酶解时间4 h，酶解温度分别为45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃。酶解pH值：酶解温度50 ℃，加酶量250 U/g，酶解时间4 h，酶解pH值分别为5、6、7、8、9。酶解时间：酶解pH 7，酶解温度50 ℃，加酶量250 U/g，酶解时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

（2）Flavourzyme风味蛋白酶脱苦工艺优化正交试验

Flavourzyme风味蛋白酶酶解大豆分离蛋白的最佳脱苦条件的确定采用L9（34）正交设计，以苦味值为评价指标，考察酶解温度、酶解pH值、加酶量、反应时间4个因素对水解液苦味评分的影响。正交试验因素与水平如表3所示。

表3 Flavourzyme风味蛋白酶脱苦工艺优化正交试验因素与水平Table 3 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing debittering process by Flavourzyme

2 结果与分析

2.1 Alcalase 2.4L酶酶解单因素试验结果

Alcalase 2.4L酶解单因素试验结果见图1。由图1A可看出，Alcalase 2.4L酶解实验过程中随着加酶量的增加，水解度显著增加，但当加酶量＞11 000 U/g后，水解速度减慢，曲线趋于水平，因此考虑酶解效果，Alcalase 2.4L酶加酶量为11 000 U/g时较为适宜。

如图1B所示，在底物质量分数较低时，大豆分离蛋白的水解度较高，当底物质量分数增加，水解度出现下降趋势，原因可能是由于大豆分离蛋白溶解度不高，当底物质量分数过高时会造成水解液黏度增大，影响蛋白酶的扩散，从而抑制水解反应的进行。因此，考虑到酶解效率和生产成本，底物质量分数在3%～5%较为适宜。

由图1C可看出，酶解温度为50～60 ℃时，水解度随温度的升高而增大；但温度＞65 ℃后，水解度迅速下降。因此，Alcalase 2.4L蛋白酶酶解大豆分离蛋白的最适温度为55～65 ℃。

如图1D所示，Alcalase 2.4L蛋白酶在pH 7.5～8.5 时对大豆分离蛋白的水解能力较强。

2.2 Alcalase 2.4L酶酶解条件优化正交试验结果

由表4极差分析可知，各因素影响效果主次关系为C＞A＞D＞B，即pH值＞加酶量＞底物质量分数＞温度，同时，得出最优组合为C3A3D2B2，即加酶量14 000 U/g、酶解温度60 ℃、酶解pH 8.5、底物质量分数5%。在此最佳条件下进行验证试验，水解1 h的水解度为41.95%。

图1 Alcalase 2.4L酶加酶量(A)、底物质量分数(B)、酶解温度(C)及酶解pH值(D)对大豆分离蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of Alcalase 2.4L addition (A),substrate concentration(B),hydrolysis temperature (C) and hydrolysis pH (D) on hydrolysis degree of SPI

2.3 酶解反应时间对酶解度的影响

由图2可知，Alcalase 2.4L蛋白酶在120 min时水解度最高，可达45.34%，此时水解液为清澈透明的浅黄色液体，仅有少量沉淀。继续延长反应时间，水解度增长趋势不明显，因此最佳水解时间应为2h。

表4 Alcalase 2.4L酶酶解条件优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing enzymatic hydrolysis by Alcalase

图2 酶解反应时间对水解度的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree of SPI

2.4 苦味分值测定

大豆蛋白经酶解后往往会产生一种令人难以接受的苦味，会影响其在食品中的应用，因此本实验评价了在最佳酶解条件下的酶解液的苦味值。由五位评定员品尝并打分后得出结论，在最佳酶解条件下（加酶量14 000 U/g，酶解温度60 ℃，酶解pH 值为8.5，底物质量分数5%，酶解时间2 h），Alcalase 2.4L蛋白酶水解液苦味评分为4。

2.5 Flavourzyme风味蛋白酶酶解单因素试验结果

Flavourzyme风味蛋白酶酶解单因素试验结果见图3。由图3A可以看出，随着酶添加量的增大，大豆分离蛋白酶水解产物苦味评分逐步降低，即苦味逐渐变小，当酶用量＞250 U/g时苦味几乎不变。这主要是由于风味酶是以疏水性专一的外切蛋白酶为主，水解后使疏水性氨基酸较多地位于多肽的末端或从游离出来，从而苦味较低。

图3 Flavourzyme酶加酶量(A)、酶解温度(B)、酶解pH值(C)及酶解时间(D)对大豆分离蛋白苦味分值的影响Fig.3 Effect of Flavourzyme addition (A),hydrolysis temperature (B),hydrolysis pH (C) and hydrolysis time (D) on bitterness value of SPI

由图3B可以看出，随反应温度升高，酶解液苦味评分下降，在50～60 ℃时苦味最小。继续升高温度，苦味评分反而略有增大。这是因为Flavourzyme风味蛋白酶的最适温度在50 ℃左右，温度太低，酶活性达不到最高。而温度过高时，对Flavourzyme风味蛋白酶的活性有抑制作用，使其达不到最佳酶解效果。

由图3C可以看出，pH值5.0～7.0阶段，苦味评分逐渐减小为1.4，而pH值由7.0升至8.0时，苦味评分又逐渐增大，从而确定适宜pH值为7.0左右。

由图3D可以看出，随水解的进行，苦味评分逐渐降低，在4 h时苦味最小，4～5 h时苦味几乎不再变化，因此适宜酶解时间范围确定在3～5 h。

2.6 Flavourzyme风味蛋白酶脱苦工艺优化正交试验结果

表5 Flavourzyme酶脱苦工艺优化正交试验结果与分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing debitterizing process by Flavourzyme

由表5极差分析可知，各因素影响苦味评分的主次关系为D＞A＞B＞C，即加酶量＞酶解pH值＞酶解温度＞酶解时间，同时，得出最佳脱苦工艺条件为A2B2C1D3，即加酶量300 U/g、酶解温度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解时间3 h。在此最佳条件下进行验证试验，苦味值为1.2，水解液几乎无苦味，脱苦效果理想。

3 结论

本试验研究了以Alcalase 2.4L碱性内切酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的工艺，同时通过加入Flavourzyme风味蛋白酶改善酶解液苦味。通过单因素和正交试验得到了Alcalase 2.4L碱性内切酶和Flavourzyme风味蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳水解工艺，使水解度得到较大提高的同时也解决了水解液的苦味问题。结果表明，Alcalase 2.4L碱性内切酶酶解最优条件是：酶解pH 8.5、酶解温度60 ℃、底物质量分数5%、加酶量为14 000 U/g，酶解时间2 h，水解度可达45.34%，水解液苦味值为4；继续加入Flavourzyme风味蛋白酶反应，水解液苦味值大大降低。试验证明，Flavourzyme风味蛋白酶脱苦工艺最佳条件是酶解温度55 ℃、酶解pH 7.0、加酶量300 U/g、酶解时间3 h，可使苦味值降低为1.2。

一般来说内肽酶水解物易产生苦味，而外肽酶水解物基本上不产生苦味，故Alcalase碱性内切酶水解大豆分离蛋白后水解物往往产生一种令人难以接受的苦味，随着大豆蛋白水解度的增大，原来包裹在分子内部呈苦味的疏水性基团暴露出来，含有的疏水性基团的多肽会使人的味蕾产生苦味。通过加入Flavourzyme风味蛋白酶可以进行脱苦处理，可以将疏水性氨基酸从蛋白质末端切掉，由于有利的疏水性氨基酸并不产生苦味，因此可以有效地减少水解液的苦味。在最佳酶解条件下，苦味分值达到最低，取得了较好的脱苦效果。

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