液化法酿造燕麦黄酒工艺条件优化

2014-04-24任贵兴

中国酿造 2014年8期

刘浩，任贵兴*

（中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）

燕麦（Avena sativaL.）又名莜麦，为禾本科（Gram-ineae）、早熟禾亚科（Pooideae）、燕麦属（Avena），一年生草本植物，是古老的饲草、饲料及粮食作物[1-2]。按照外稃的性状可分为有稃型的皮燕麦与无稃型的裸燕麦两类，我国以种植裸燕麦为主。燕麦籽粒食用为主，通常认为裸燕麦的营养价值比皮燕麦更高[3]。燕麦是营养与医疗保健价值较高的谷物，蛋白质含量很高，富含可溶性膳食纤维、β-葡聚糖、酚酸、蒽酰胺（avenanthramides）、类黄酮、维生素E等化合物[4]。如此丰富的营养与功能成分使得燕麦及其制品有多种生物活性，如降血脂[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、免疫增强[8]等。燕麦食用加工历史悠久，主要是以燕麦谷物早餐等形式出现[1]。在我国，大部分燕麦用于制粉，进而制作燕麦传统食品（如莜面、栲栳栳）、燕麦面包与饼干[9]等。近年来含有或使用燕麦作为主要原料制作的谷物饮料、豆浆、酸奶等饮品也有出现[10-12]。

黄酒酿造历史悠久，传统酿造工艺历经几千年的不断改进和完善已达到很高的水平，但仍然存在生产周期长、原料利用率不高、人工劳动强度大等缺点。黄酒酿造新工艺在传统工艺的基础上进行改进。液化法是黄酒酿造新工艺的其中一种，基本过程是将原料粉碎后使用酶制剂和微生物进行液化、糖化、发酵，该工艺对于原料的选择范围更广、利用率更高，此外还具有醪液流动性可控、易于机械化生产等优点[13-14]。液化法用于杂粮酒酿造已有相关报道，如苦荞酒[15]、薏米酒[16]、紫薯酒[17]等。

本研究以炒制并磨碎的裸燕麦为原料，以葡萄糖当量值、还原糖含量、固形物含量等作为综合评价指标，通过单因素试验与正交试验对液化法酿造燕麦黄酒的液化、糖化、主发酵工艺条件进行优化，旨在为燕麦黄酒的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裸燕麦：取自河北省张家口市农业科学院；耐高温α-淀粉酶（40 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）均为食品级：江苏瑞阳生物科技有限公司；黄酒活性干酵母、甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；氢氧化钠、酒石酸钾钠均为分析纯：西陇化工股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、无水亚硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；重蒸酚、葡萄糖（分析纯）：上海Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

GTJ-368滚筒式电加热炒货机：青岛德维机械制造有限公司；WK-400A试验室小型高速粉碎机：山东青州精诚机械有限公司；PB602电子天平（感量0.01 g）、PB203电子天平（感量0.001 g）：METTLER TOLEDO集团；3FG-01B电热恒温干燥箱：湖北省黄石市医疗器械厂；TD25-WS多管架自动平衡离心机：湘仪离心机仪器有限公司；4802UV/VIS分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；RP-300B人工气候箱：中国南京恒裕电子仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

还原糖的测定采用DNS法[18]：待测液4 500 r/min离心5 min，取上清液稀释至适宜倍数待测；葡萄糖标准曲线的制备，配制不同葡萄糖含量的反应液，再加入3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3.5 mL，轻摇混匀，沸水浴10 min显色，冷却后用纯净水定容至20 mL，颠倒混匀。在波长540 nm处比色，以去离子水为空白，测出各管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得到回归方程，计算还原糖含量。

固形物含量的测定参照GB/T 13662—2008《黄酒》中总固形物的测定方法执行，略有改动。吸取稀释至合适倍数的试样5 mL于已知干燥至质量恒定的蒸发皿中，放入（103±2）℃的电热干燥箱中烘干4 h，取出称质量（g），按照下式计算固形物含量。

葡萄糖当量值（dextrose equivalent，DE）值[19]的计算公式：

酒精度、非糖固形物、总糖、总酸、氨基酸态氮、pH值、氧化钙、β-苯乙醇、铅、微生物含量的测定均按照GB/T 13662—2008《黄酒》中的测定方法执行。

1.3.2 传统方法与液化方法酿造燕麦黄酒对比试验设计

分别采用北方黄酒传统酿造工艺与液化工艺进行初步试验，选取籽粒饱满、无霉变、无虫蛀的燕麦，除去杂质，润麦调节水分至25%，平衡12 h。在200～220 ℃炒制20 min，冷却干燥12 h。粉碎机粉碎过40目标准筛，备用。

传统工艺：

炒制燕麦米→浸米12 h→蒸煮→接种→30 ℃前酵→16 ℃后酵→压榨→酒样

液化工艺：

炒制燕麦米→粉碎→加水混匀→耐高温α-淀粉酶液化→糖化酶糖化→接种→30 ℃前酵→16 ℃后酵→压榨→酒样。

两种酿造方法的加水量一致，前发酵每隔12 h 测定一次相对失质量（测定前充分搅拌醪液使气体散出，相对失质量为醪液初始质量减去时间节点时的测定质量），并测定压榨后酒样的酒精度、总糖含量与固形物含量。

1.3.3 燕麦黄酒液化与糖化工艺优化试验设计

液化醪液的DE值控制一般在15%～20%[19-20]。液化DE值低，料液易老化、黏度大、难于操作，也不利于糖化；液化程度过高不利于糖化过程酶与底物形成络合结构，影响催化效率。

液化时间对液化程度的影响，分别称取经过预处理的燕麦粉，料水比1∶3.5混匀，依照酶活与燕麦粉质量之比5 U/g的量加入耐高温α-淀粉酶，混匀后升温至95 ℃分别液化10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，稀释后4 500 r/min离心取上清液，测定还原糖含量与固形物含量，计算DE值。耐高温α-淀粉酶添加量对液化程度的影响试验，酶活与燕麦粉质量之比分别为3 U/g、4 U/g、5 U/g、6 U/g、8 U/g、10 U/g。液化温度对液化程度的影响试验，温度分别为80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃。

根据单因素试验所得结果选择合适的水平范围，使用L9（34）正交表，以DE值为指标设计3因素3水平的正交试验确定最优条件组合。

1.3.4 燕麦黄酒糖化工艺优化试验设计

时间对糖化效果的影响：依照酶活与燕麦粉质量之比80 U/g的量加入糖化酶，混匀，60 ℃分别糖化30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min，稀释后4 500 r/min离心取上清液，测定还原糖含量与固形物含量，计算DE值。糖化酶添加量对糖化效果的影响：酶活与燕麦粉质量之比分别按50 U/g、60 U/g、70 U/g、80 U/g、90 U/g、100 U/g、110 U/g的量加入糖化酶。温度对糖化效果的影响：温度分别为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃。正交试验设计同液化工艺优化。

1.3.5 燕麦黄酒主发酵工艺优化试验设计

据相关文献报道，主发酵时间多集中于3 d[15-17]，本试验适当延长发酵时间至5 d，以消耗更多的糖分并促进香气成分的产生。

调整燕麦粉与水的质量之比1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0、1∶4.5，接种酵母量为燕麦粉质量的0.15%，30 ℃分别发酵5 d，醪液4 500 r/min离心取上清液，测定酒精度。酵母接种量对主发酵结果的影响：接种酵母量为燕麦粉质量的0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。温度对主发酵结果的影响：发酵温度为25 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃。在单因素试验基础上，使用L9（34）正交表，以酒精度为指标设计正交试验确定最优条件组合。

1.3.6 数据处理方法

测定试验均重复两次，结果为平均值的方式表示。使用OEA3.1软件进行正交试验设计，SAS 9.1进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 传统方法与液化方法酿造燕麦黄酒对比试验

图1 传统方法与液化方法的发酵曲线Fig.1 Fermentation curves of traditional method and liquefaction method

前发酵过程中醪液的相对失质量测定结果见图1，醪液的相对失质量能表征发酵的速度与最终原料利用率。由图1可以看出，液化法起初的发酵速度较慢，这可能是因为前处理过程中淀粉糖化、液化程度较高，使得醪液糖度较高，对发酵母增殖起到抑制作用。但抑制作用解除后，液化发酵速率明显加快（图1中段），且高于传统方法。从终点的相对失质量来看，液化法酿造对原料的利用率要比传统方法高。同时对两种方法得到的酒样测定结果表明，液化法酒样的酒精度（12.6±0.1）%vol与总固形物（52.8±2.0）g/L含量明显高于传统方法（11.1±0.3）%vol，（47.0±0.8）g/L，但液化法酒样总糖含量（19.6±0.3）g/L却低于传统方法（23.7±0.4）g/L，这说明液化法酿造黄酒有更高的原料利用率。

2.2 液化法酿造燕麦黄酒最佳液化工艺条件的确定

2.2.1 液化时间对液化程度的影响

液化时间对液化程度的影响结果见图2。由图2可知，液化开始时首先是淀粉酶分解直链淀粉产生寡糖，此酶促反应速度较快。而后淀粉酶作用于支链淀粉，同时使得部分寡糖水解，但此时酶解产物的积累与1,6-糖苷键相对比例的增大会使得酶促反应速度下降[21]。由图2可以看出，还原糖含量的增加速度比干物质含量增加的速度要快，30 min时DE值达到最大，但是此时的还原糖含量却没有达到最大值。而当40 min以后DE值虽稍有降低，但还原糖的含量平稳，干物质量略有升高。因此选择30～50 min作为较优液化时间。

图2 液化时间对液化程度的影响Fig.2 Effect of time on liquefaction degree

2.2.2 耐高温α-淀粉酶添加量对液化程度的影响

耐高温α-淀粉酶添加量对液化程度的影响结果见图3。由图3可知，在酶促反应中，底物浓度足够高时，酶促反应速度随着酶添加量的增加而提高[22]。由图3可知，随着酶添加量的增大，还原糖与干物质含量均有升高。当液化醪液化程度（DE值）控制在15%～20%时，利于后续液化与发酵。酶添加量＞5 U/g时，DE值上升过快，不利于生产控制。因此选择3～5 U/g作为较优淀粉酶添加量。

图3 耐高温α-淀粉酶酶添加量对液化程度的影响Fig.3 Effect of thermostable α-amylase addition on liquefaction degree

2.2.3 液化温度对液化程度的影响

液化温度对液化程度的影响见图4。由图4可知，在一定温度内，酶促反应速度随温度的升高而增快，至最适反应温度后，继续升高温度会造成部分酶的失活，使反应速度下降[22]。由图4可知，在温度＞95 ℃后还原糖含量有所降低；但干物质含量随着温度的升高而增大；在95 ℃时DE值最高，因此得到最适液化温度为90～100 ℃。

图4 温度对液化程度的影响Fig.4 Effect of temperature on liquefaction degree

2.2.4 液化条件正交试验优化

根据单因素试验所得结果选择合适的水平范围，使用L9（34）正交表，以DE值为指标设计正交试验确定最优液化条件组合。其试验设计与结果见表1，方差分析见表2。

表1 液化条件优化正交试验设计与结果Table 1 Design and results of orthogonal test for liquefaction conditions optimization

由表1与表2可以看出，液化条件对于液化程度的影响均显著（P＜0.05），主次顺序为酶添加量＞温度＞时间。由正交试验得到的最佳组合为A2B3C2。即液化温度95 ℃、液化酶添加量5 U/g、液化时间40 min，在此条件下进行验证试验，DE值为21.96%。

表2 液化正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of liquefaction orthogonal tests results

2.3 液化法酿造燕麦黄酒最佳糖化工艺条件的确定

2.3.1 糖化时间对糖化程度的影响

糖化时间对糖化效果的影响见图5。由图5可知，150 min之前糖化醪的还原糖含量随时间的推移而升高，在150 min后变化不大，趋于平缓，180 min后基本达到稳定。DE值的变化趋势与之类似。为保证糖化质量，选取120～180 min作为较优糖化时间。

图5 糖化时间对糖化效果的影响Fig.5 Effect of time on the saccharification

2.3.2 糖化酶添加量对糖化程度的影响

图6 糖化酶添加量对糖化效果的影响Fig.6 Effect of glucoamylase addition on the saccharification

糖化酶添加量对糖化程度的影响见图6。由图6可知，底物浓度足够高时，酶促反应速度与酶添加量存在正相关关系。糖化酶添加量为110 U/g时，与糖化酶添加量100 U/g时相比，DE值略有升高但还原糖含量没有明显差异，同时兼顾成本因素，确定80～100 U/g为较优糖化酶添加量。

2.3.3 温度对糖化程度的影响

温度对糖化程度的影响见图7。温度能显著影响酶促反应，在适宜的温度范围内，酶促反应随着温度的升高加快，至最适反应温度时到达最快。若温度继续升高，会导致酶失活，使得酶促反应速度降低。由图7可知，还原糖含量、干物质含量与DE值在温度≤65 ℃范围内逐渐升高，但＞65 ℃后糖化酶失活严重，三个指标均降低，均因此确定最适反应温度为60～70 ℃。

图7 糖化温度对糖化效果的影响Fig.7 Effect of temperature on saccharification

2.3.4 糖化条件优化正交试验

表3 糖化条件优化正交试验设计与结果Table 3 Design and results of orthogonal test for saccharification conditions optimization

根据单因素试验所得结果选择合适的水平范围，使用L9（34）正交表，以DE值为指标设计正交试验确定最优糖化条件组合。试验设计与结果见表3，方差分析见表4。

表4 糖化条件正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of saccharification orthogonal tests results

由表3、表4可以看出，糖化条件对糖化程度均有极显著的影响（P＜0.01），主次顺序为温度＞糖化酶添加量＞时间。由正交试验直观分析得到的最佳组合为A2B3C3。即温度65 ℃，糖化酶添加量100 U/g，时间180 min，此时DE值为77.21%。

2.4 主发酵条件优化正交试验

图8 料液比（A）、酵母接种量（B）与发酵温度（C）对酒精度的影响Fig.8 Effect of material to water ratio(A),yeast inoculum(B) and fermentation temperature(C) on alcohol content

2.4.1 主发酵条件优化单因素试验

主发酵条件优化单因素试验结果见图8。随着料液比、酵母接种量和温度的增加，酒精度均呈先上升后下降的趋势。由图8可知，料液比对醪液酒精度有明显影响。加水量较少时，酒精度较低，是因为发酵程度不够，原料未得到充分利用，酒精转化效率低。加水量较多时，由于稀释作用，酒精度也很低，因此确定最佳料液比为1∶3.5；酵母接种量对酒精度的影响极为明显。酵母接种量较少，原料不能充分发酵；酵母接种量过大则会使得酵母繁殖过快，将部分糖用于自身生长，使酒精度偏低，因此确定最佳酵母接种量为0.25%；当温度较低时，酵母代谢与繁殖均会很慢。当温度很高时，酵母代谢与繁殖速率过快，这会导致酵母老化。因此确定最佳主发酵温度为30 ℃。

2.4.2 主发酵条件优化正交试验结果

根据单因素试验所得结果，以酒精度为指标设计正交试验确定主发酵最优条件组合。试验设计与结果见表5，方差分析见表6。

表5 主发酵条件优化正交试验设计与结果Table 5 Design and results of orthogonal test for main fermentation conditions optimization

表6 主发酵条件正交试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of main fermentation orthogonal tests result

由表5、表6可以看出，料液比、酵母接种量与发酵温度对酒精度均影响显著（P＜0.05），其中料液比和酵母接种量达到了极显著水平（P＜0.01），影响大小顺序为料液比＞酵母添加量＞温度。分析得到最佳条件组合为A2B2C2，即料液比1∶3.5、酵母添加量0.25%、发酵温度30 ℃，在此条件下进行验证试验，酒精度为9.2%vol，发酵结束后的残糖量为10.19 mg/mL。

2.5 最佳工艺条件下燕麦黄酒酿造试验结果

最佳酿造工艺条件下，再经过16 ℃、30 d的后发酵，压榨得到的燕麦黄酒呈橙黄色，清亮透明，口味醇和爽口，但有区别于普通稻米黄酒的燕麦发酵特殊香气。具体品质指标测定结果及国标范围见表7。由表7可知，在最佳工艺条件下，黄酒酒样分析结果符合国家标准的各项要求。

表7 最佳工艺条件下燕麦黄酒品质指标Table 7 Basic quality indicators of Chinese oat rice wine under the optimal conditions

3 结论

通过单因素与正交试验确定了燕麦黄酒的最佳工艺条件，即最佳液化工艺条件为耐高温α-淀粉酶添加量为5 U/g、液化温度95 ℃、液化时间40 min；最佳糖化条件为糖化酶添加量100 U/g、糖化温度65 ℃、糖化时间180 min；最佳主发酵工艺条件为料液比1∶3.5、发酵温度30 ℃、酵母添加量为0.25%、发酵时间5 d。在此条件下，16 ℃稳定30 d后得到燕麦黄酒。酒样分析结果符合国家标准的各项要求。本研究及结果可为燕麦黄酒工业化生产提供理论依据。

[1]周素梅，申瑞玲.燕麦的营养及其加工利用[M].北京：化学工业出版社，2009.

[2]XU J G,TIAN C R,HU Q P,et al.Dynamic changes in phenolic compounds and antioxidant activity in oats (Avena nudaL.) during steeping and germination[J].J Agr Food Chem,2009,57(21):10392-10398.

[3]BIEL W,BOBKO K,MACIOROWSKI R.Chemical composition and nutritive value of husked and naked oats grain[J].J Cereal Sci,2009,49(3):413-418.

[4]SINGH R,DE S,BELKHEIR A.Avena sativa(Oat),a potential neutraceutical and therapeutic agent:an overview[J].Criti Rev Food Sci Nutr,2013,53(2):126-144.

[5]TRUSWELL A S.Cereal grains and coronary heart disease[J].Eur J Clin Nutr,2002,56(1):1-14.

[6]TAPPY L,GÜGOLZ E,WÜRSCH P.Effects of breakfast cereals containing various amounts ofβ-glucan fibers on plasma glucose and insulin responses in NIDDM subjects[J].Diabetes care,1996,19(8):831-834.

[7]XU W,ZHANG Z W,WU B,et al.Genetic diversity in naked oat(Avena nuda)germplasm revealed by AFLP markers[J].Acta Agronomica Sinica,2009,35(12):2205-2212.

[8]BOISNIC S,BRANCHET M C,ERMOSILLA V.Healing effect of a spray containing Rhealba oat colloidal extract in an in vitro reconstitution model of skin[J].Int J Tissue React,2004,27(3):83-89.

[9]胡新中.燕麦食品加工及功能特性研究进展[J].麦类作物学报，2005，25（5）：122-124.

[10]任长忠，胡新中.中国燕麦产业发展报告2010[M].西安：陕西科学技术出版社，2011.

[11]汪建国，沈玉根，黄炎远，等.燕麦红曲黄酒的研制[J].中国酿造，2013，32（2）：152-154.

[12]涂璐，王爱莉，李再贵.燕麦红曲黄酒多酚含量及抗氧化性研究[J].中国酿造，2012，31（1）：43-45.

[13]谢广发.黄酒酿造技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.

[14]王梅，赵光鳌，帅桂兰，等.液化法酿造黄酒的研究[J].酿酒，2003，29（2）：93-95.

[15]陈佳昕，赵晓娟，吴均，等.液态法苦荞酒工艺条件的优化[J].食品科学，2013，34（20）：180-192.

[16]郭克娜，姜璐璐，阚建全.薏米酒发酵前淀粉液化及糖化条件的优化[J].食品科学，2013，34（5）：197-201.

[17]杨雅利，阚建全，沈海亮，等.紫甘薯酒发酵工艺条件的优化[J].食品科学，2012，33（3）：157-162.

[18]韩德权，章佳佳.DNS 法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究[J].食品工业科技，2008（2）：285-286.

[19]吴秀媛.啤酒酿造过程所用辅料大米糊化，液化工艺研究[J].啤酒科技，2006（4）：55-56.

[20]颜怀伟.大米直接磨浆酶液化酸糖化主发酵提取酒精生产燃料酒精方法：中国，CN1958804 B[P].2010-06-23.