黄千贻 李慕军江 莉 吴惠梅

广西医科大学第一附属医院生殖中心（南宁 530021）

·研究简报·

血小板活化因子和A23187对精子顶体反应的影响

黄千贻 李慕军*江 莉 吴惠梅

广西医科大学第一附属医院生殖中心（南宁 530021）

顶体反应（AR）是精子受精过程中的一个必要过程。在IVF或体内自然受精过程中，精子的AR是由透明带糖蛋白受体诱发的[1]，只有透明带诱发的AR才具有重要生理意义。但是目前无法分离出足够的此类物质以常规测定精子顶体功能并应用于诊断，所以需要研究天然AR激动剂的替代物及建立最佳诱导AR体系，这样诱导的AR才更符合生理要求。已知大量的内源性因子可以调节精子生育的潜能，其中包括血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）。有研究表明，PAF除有血小板激活功能外，其还能诱导动物精子体外获能和发生顶体反应[2,3]。本实验采取钙离子载体（A23187）诱导人精子AR作为阳性对照组，以探讨PAF对人精子AR的影响，为寻求天然AR激动剂的替代物及建立最佳诱导AR体系提供有力的理论依据，同时为不育症的诊治开辟一条新的途径。

材料方法

一、试剂准备

1. PAF贮存液：0.3mL PAF溶液稀释于114mL氯仿和甲醇的混和液中（氯仿:甲醇为1:4），配成终浓度为10-5mol/L的溶液，分装后储存于-20℃备用。

2. FITC-PSA贮存液：2mgFITC-PSA溶于20mL PBS（pH值7.4），1mL分装，4℃避光保存。

3. A23187：1mgA23187溶解于1mL DMSO中，配成终末浓度为1mg/mL溶液，少量分装后-20℃避光保存备用，此过程避光操作。

4. 荧光DNA粘合染料（Hoechst33258，H258）：取1mg溶于50mL PBS（pH值7.4）中，配成终末浓度为100μg/mL的溶液，分装后-20℃避光保存备用。

二、样本和精液制备

32例为接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗患者，女方为继发不孕患者，男方为健康且曾使女方怀孕患者，精液常规各项指标均在正常范围（符合WHO人类精液分析标准2001年）。取卵日当天早上嘱男方以手淫法获取精液（禁欲2～7d），装入无菌取精杯中，液化后进行精液常规分析。精液处理采用40%、80% percoll密度梯度离心法，三次离心后去部分表层，留至0.5mL精液，取部分上层液，加入ART-1020显微镜下调整密度2～5×106/mL至少2mL备用。将至少2mL已制备好的精子悬液放入37℃含有5%CO2恒温培养箱继续培育4h，使其获能。

三、诱导顶体反应和评估顶体状态

PAF组取10μl PAF贮存液置于1.5mL硅化管内，氮气干化后放入37℃、5%CO2培养箱预平衡1h，然后加入500μl制备好的精子悬液，PAF终浓度为10-7mol/L[2]；阳性对照组加入相同的500μl精子悬液，同时加入2.6μl A23187溶液，使其终末浓度为10μmol/L；空白对照组加入含等量DMSO的溶液（DMSO浓度＜1%）。三组均放入37℃含有5%CO2恒温培养箱培育15min后转移至对应离心管内，加入H258溶液5μl，继续培育5min。用0.9%生理盐水150g离心10min洗涤2次。弃去上清液，取精子沉淀20μl进行FITC-PSA染色。将20μl精子沉淀制片后，室温下避光自然干燥, 95%酒精固定30min，超纯水冲洗15min，甩干。取1mL FITC-PSA贮存液加入1mLPBS液，配成终末浓度为50μg/mL，常温下将固定好的精子涂片用FITC-PSA避光染色30min。12.5%戊二醛溶液终止AR。超纯水冲洗10min，自然风干。滴加含0.22mol/L DABCO的甘油溶液作为荧光封固剂封片。4℃下避光短暂保存，采用病理图像分析仪荧光显微镜（德国LEICA，DMR+Q550），100×油镜观察。每张精子涂片检查四方和中央共5个区域，计数≥200个精子，计数发生AR的活精子数并换算成百分率。记录，存图。

四、结果分析

1. 顶体完整，活精子：Hoechst 33258-/PSA+ 顶体帽有黄绿色荧光而核区无蓝光。

2. 顶体完整，死精：Hoechst 33258+/PSA+ 顶体帽有黄绿色荧光，核区有蓝光。

3. 发生顶体反应，活精子： Hoechst33258-/ PSA+ Ⅰ型 顶体帽部分脱落，精子头部帽状球形黄绿色荧光呈不均匀，核区无蓝光—表示刚发生AR不久，顶体内容物尚未完全丢失；Ⅱ型 顶体帽全部脱落，精子头部帽状球形下保留一明显条带状（赤道板状）黄绿色荧光染色区，核区无蓝光—表示完全发生AR者；或Hoechst 33258-/PSA- Ⅲ型顶体区和顶体后区均无荧光，核区无蓝光—表示全顶体破裂，是早已完成AR者。

4. 顶体缺失，死精：Hoechst 33258＋/PSA- 顶体帽无荧光，核区有蓝光。

五、统计学分析

所有数据统计分析采用SPSS17.0统计软件包，组内各AR%均呈近似正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两两组间比较采用配对均数比较t检验，当P＜0 .05说明差异具有统计学意义。

结 果

PAF组人精子AR%（29.90±10.815）和A23187组人精子AR%（54.93±1.320）均明显高于空白对照组的自发性AR%（13.54±7.820）；PAF组人精子AR%（29.90±10.815）低于A23187组人精子AR%（54.93± 1.320），差异均有统计学意义（P＜0.01）。 此外，根据世界卫生组织精液分析手册（WHO，2001）的标准，钙离子载体激发（ARIC）的实际AR为A23187组%AR减去空白对照组%AR，本实验ARIC%AR为（41.39±15.15）%。根据手册，ARIC%AR的正常值为15%，如＜10%为异常，10%～15%之间提示精子功能可能异常。本实验结果大于15%，提示所取对象精子顶体功能正常。

讨 论

本实验通过PAF和A23187诱导人精子顶体反应，研究两者对精子顶体反应的影响。为避免死精或退化顶体丢失造成AR的假相，因而检测AR必须同时检测是否为活精子。本实验采用Hoechst33258联合FITCPSA标记法[4]，对精子进行双重染色剔除死精子对AR发生率的干扰，可以同时测得精子顶体状态及是否是活精子。FITC受激发光（450nm～490nm）的照射而发出明亮的荧光（黄绿色），Hoechst33258受紫外光（280nm～360nm）照射发出蓝光。

本实验结果表明，PAF和A23187均能诱导人精子发生AR，但两者诱导AR的强度不同，PAF组顶体反应率明显低于A23187组，可能是A23187的作用超过了正常的生理反应。由于A23187一方面可使大量精子迅速致死，另一方面由于它具毒性，因此，A23187诱发AR主要用于科研。

迄今已知透明带、透明带溶解液或提纯的透明带分子组分ZP与获能精子培养，均可诱导 AR。因为这类成分是天然物质，故通常认为这样诱导的AR代表或接近于体内发生的自然AR。有研究表明活精子的AR%与精子的卵透明带穿透率呈强正相关，透明带诱发精子AR%已成为评价精子功能的一个可靠的指标[5,6]。但是一个存在的问题是无法获得大量天然的人透明带用于临床不育诊断研究。因此，体外要准确评价人类精子AR功能，需要有合适的生理性诱导因子，这样诱导AR才更接近生理性。国外采用完整人卵透明带诱导精子AR，其发生率平均为45%[5]；国内有研究采用人透明带糖蛋白诱导人精子， AR%为（32.45±6.92）%[7]；采用可溶性人ZP，诱导精子AR%约为30%[8]；而采用与人卵透明带有交叉反应性的小鼠，ZP诱导人精子AR，其发生率只有22%～30%[9,10]。本研究发现PAF诱导的精子AR%虽不及A23187高，但PAF诱导的AR%结果（29.90± 10.815）%与上述学者用天然物质诱导精子AR%的结果接近[10,11]。提示PAF诱导人精子的AR可能更具有实用价值，其是否可为人类AR的研究和AR缺陷综合征的临床诊断提供有利的手段，临床上帮助不孕夫妇选择合适的助孕方式并预测IVF受精失败，仍有待通过进一步研究PAF诱导的人精子AR与透明带诱导的人精子AR的关系来证实。

目前PAF对人精子AR的确切作用机制尚不清楚。多位学者在精子尾部颈段和中段发现了PAF受体（PAF receptor，PAFR）浓度最高[12]。颈段是近端中心粒的位置，PAF可能对中心粒完整的精子有刺激影响，而精子尾部中段既是线粒体场所也是精子活动的关键部位。胞内Ca2+浓度增加是诱导精子获能和AR的必须条件。推测PAF是通过受体介导调控胞内Ca2+浓度影响精子活力和受精潜力，提高成功受精率及胚胎发育率。近年来有学者在猪精子上检测到PAF受体，同时认为钙离子诱导的顶体反应是通过PAF刺激来调节的[13]。PAF对精子功能的影响是受体介导的属于IP3、二酰甘油（diacylglycerol，DAG）、Ca2+的信使系统[14]：PAF通过与细胞上特异性G蛋白受体结合后激活磷酸肌醇特异性的磷脂酶C（phospholipase C，PLC），催化质膜上磷脂酰肌醇（phosphatidyl inosito，PI）水解，产生两个第二信使——IP3和DAG，IP3通过两条途径引起胞内Ca2+浓度的升高：（1）细胞线粒体内储存Ca2+的释放；（2）细胞外Ca2+通过通道向细胞内转运。继之激活蛋白激酶C（protein kinase，PKC），催化靶蛋白磷酸化而发挥生物学效应[15]。Sengoku等[16]研究发现，PKA、PKC、PTK的抑制剂能降低PAF诱导的AR%，这就提示这三者信号途径的转导可能参与调节PAF诱导AR。

本研究除了发现A23187诱导的精子AR%明显高于PAF外，还发现了A23187诱导AR精子类型主要是Ⅱ型，属完全AR，说明诱导AR时间快（见图1）；而PAF诱导AR精子类型主要属于Ⅰ型，属部分AR（见图2）。主要原因可能与两者诱导AR机制不同有关。A23187作为亲脂性Ca2+载体，通过Ca2+和H+交换，使胞外Ca2+大量流入细胞内，促进cAMP产生，进而激活了cAMP-PKA系统，最终使一些蛋白质磷酸化，调节了精子质膜融合，同时钙离子启动细胞骨架系统，从而诱导出类似胞吐的AR。

图1 A23187 组(Ⅱ型为主)

图2 PAF 组(Ⅰ型为主)

综上所述，A23187和PAF均可用于检测获能精子发生AR的能力。在相同的获能及诱导时间下，PAF诱导的AR与A23187诱导的AR有显著性差异，从而也说明了PAF和A23187诱导的AR不同。PAF作为一个内源性因子，其诱导人精子AR的能力可能更接近于生理透明带诱导的能力，推测其能更真实反映精子AR的情况。

精子; 血小板活化因子; 顶体反应

1 Wassarman PM. Mammalian fertilization molecular aspects of gametes adhesion, exocytosis, and fusion.Cell1999; 96(2): 175-183

2 Kordan W, Lecewicz M, Tobolski J. Effect of plateletactivating factor on motility, plasmalemma integrity, the process of capacitation and acrosome reaction of fresh and cryopreserved boar spermatozoa.Pol J Vet Sci2009; 12(2): 175-181

3 Bragado MJ, Gil MC, Garcia-Marin LJ. Platelet-activating factor in Iberian pig spermatozoa: receptor expression and role as enhancer of the calcium-induced acrosome reaction.Reprod Domest Anim2011; 46(6): 943-949

4 Jankovicová J, Simon M, Antalíková J,et al. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.Acta Vet Hung2008; 56(1): 133-138

5 Liu DY, Baker HW. Disordered zona pellucida-induced acrosome reaction and failure of in vitro fertilization in patients with unexplained infertility.Fertil Steril2003; 79(1): 74-80

6 Liu DY, Garrett C, Baker HW. Clinical application of sperm-oocyte interaction tests in vitro fertilizationembryo transfer and intracytoplasmic sperm injection programs.Fertil Steril2004; 82(5): 1251-1263

7 曹翔, 刘悦, 陈国武, 等. 体外诱导人精子顶体反应方法的比较. 中国男科学杂志 2010; 24(7): 17-20

8 Franken DR, Bastiaan HS, Oehninger SC. Physiological induction of the acrosome reaction in human sperm: validation of a microassay using minimal volumes of solubilized, homologous zona pellucida.J Assist Reprod Genet2000; 17(3): 156-161

9 Lee MA, Trucco GS, Bechtol KB,et al. Capacitation and acrosome reaction in human spermatozoa minitored by a chlortetracycline f uorescence assay.Fertil Steril1987; 48(4): 649-658

10 林芸秀, 江一平. 小鼠透明带溶解液诱导人精子顶体反应. 福建医科大学学报 1998; 32(1): 22-25

11 Esterhuizen AD, Franken DR, Lourens JG,et al. Clinical importance of zona pellucida-induced acrosome reaction and its predictive value for IVF.Hum Reprod2001; 16(1): 138-144

12 Roudebush WE, Purnell ET. Platelet-activating factor content in human sperm and pregnancy outcome.Fertil Steril2000; 74(2): 257-260

13 Bragado MJ, Gil MC, Garcia-Marin LJ. Platelet-activating factor in Iberian pig spermatozoa: receptor expressionand role as enhancer of the calcium-induced acrosome reaction.Reprod Domest Anim2011; 46(6): 943-949

14 Roudebush WE, Mayorov V, Adkison LR,et al.Abnormal sequence of the platelet-activating factor receptor in nonmotile spermatozoa.Fertil Steril (Suppl)2002; 76: 460-461

15 Purnell ET, Roudebush WE, Sengstacke FD,et al. Platelet-activating factor stimulates intracellular calcium levels in exposed sperm.Fertil Steril2001; 76(3,suppl 1): S57

16 Sengoku K, Tamate K, Takuma N,et al. Involvement of protein kinases in platelet activating factor-induced acrosome reaction of human spermatozoa.Mol Hum Reprod1996; 2(6): 401-404

（2013-11-11收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.017

Q545; R321.1

*通讯作者, E-mail: lmj1699@vip.163.com