沈寒坚 朱广友沈 彦 王飞翔 翁少峥

司法部司法鉴定科学技术研究所, 上海市法医学重点实验室（上海 200063）

神经性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体内氧化应激状态研究*

沈寒坚 朱广友**沈 彦 王飞翔 翁少峥

司法部司法鉴定科学技术研究所, 上海市法医学重点实验室（上海 200063）

目的通过海绵体神经损伤建立神经性勃起功能障碍大鼠，研究其阴茎海绵体组织内氧化应激状态，及其对于大鼠阴茎勃起功能的影响。方法取成年雄性SD大鼠60只，随机分为3组：A组为假手术组（Sham组），B组为单侧海绵体神经切断组，C组为双侧海绵体神经切断组。各组大鼠造模手术后8周，进行勃起功能试验后处死，取大鼠阴茎海绵体组织，测定大鼠阴茎海绵体组织中超氧化物歧化酶（SOD）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活力，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量，以及NADPH氧化酶gp91phox和p22phox亚基的mRNA表达情况。结果单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织SOD水平、GSH-PX活性低于假手术组。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织MDA含量高于于假手术组。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织NO浓度和eNOS活力均低于假手术组。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织内NADPH氧化酶的gp91phox亚基和p22phox亚基mRNA的相对表达倍数均高于假手术组。结论 通过对大鼠阴茎海绵体组织氧化应激相关指标（SOD、GSH-PX、MDA）、血管内皮功能相关指标（NO、eNOS）以及NADPH氧化酶功能亚基mRNA的相对表达倍数的测定，单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的上述指标与假手术组之间均存在统计学差异，说明大鼠海绵体神经损伤致阴茎勃起功能障碍的过程中，除了本身神经损伤以外，阴茎海绵体组织的氧化应激以及NADPH氧化酶相关的阴茎海绵体血管内皮损伤也是大鼠神经性ED的发生、发展的重要机制之一。

勃起功能障碍; 氧化性应激; NADPH氧化酶

神经性阴茎勃起功能障碍（NED）约占ED的10%～19%，主要的相关病变包括急性神经损伤、前列腺癌、糖尿病和帕金森病等，海绵体神经（CN）的损伤最为常见，是最主要的致病因素。盆腔恶性肿瘤术后或者外伤后，ED的发生率明显升高，因为在手术及外伤过程中CN可能会被切断、撕裂或者牵拉等，从而造成其损伤。CN的失用会破坏海绵体的勃起疲软循环，进一步引起海绵体平滑肌结构上的损伤，从而发生继发性的勃起功能慢性丧失。CN损伤后导致勃起功能障碍的机制尚未完全阐明，其中细胞活性氧所致的氧化应激反应被认为是最重要的机制之一。本研究通过损伤CN，来构建大鼠NED模型，并对大鼠阴茎海绵体组织内氧化应激状态，及其对于大鼠勃起功能的影响进行研究。

材料与方法

一、实验动物

取成年雄性SD大鼠60只（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供），体质量200～300g，实验大鼠进入研究前交配试验证实均有正常的性功能，在14 h光照/10 h黑暗周期恒温环境下圈养,随意进食,直至试验的当天。将 60只大鼠分为3组：A组为假手术组（Sham组），即大鼠下腹正中切口后，暴露并游离出盆腔星状神经节（MPG）和海绵体神经，不经任何其他处理即缝合关闭腹膜和皮肤；B组为单侧海绵体神经切断组，步骤如第一组，在关腹前用切断一侧海绵体神经，造成一侧海绵体神经损伤，之后关闭缝合腹膜和皮肤；C组为双侧海绵体神经切断组，步骤如第一组，在关腹前用切断双侧海绵体神经，造成双侧侧海绵体神经损伤，之后关闭缝合腹膜和皮肤。大鼠行手术处理后，继续上述方法饲养8周。

二、手术方式

所有手术均在无菌操作下完成，以4%水合氯醛（1ml/100g）大鼠腹腔注射麻醉。将已麻醉的大鼠仰卧固定于解剖板上，行下腹正中切口，提起包皮沿阴茎背侧正中剪开皮肤，直至耻骨联合下方，长约3cm，游离腹侧阴茎皮肤近端至睾丸上极,打开腹腔，提出睾丸，暴露背侧前列腺，在10倍外科显微镜下仔细游离前列腺两侧叶后方，可暴露出盆腔星状神经节，沿盆腔星状神经节向周围仔细分离可识别出盆神经、腹下神经这两支主要的输入支以及沿尿道侧面走行的最大输出支-海绵体神经。所有神经均经多道生理记录仪（美国BIOPAC 公司，MP150 型）电刺激，观察阴茎勃起反应予以确认。依上述分组方法制备动物模型。

三、模型评估

大鼠行手术造模后8周，进行海绵体内注射血管活性药物试验进行动物模型评估。取盐酸罂粟碱注射液（1mL:30mg，东北制药集团公司沈阳第一制药厂），用0.9%生理盐水稀释，使之浓度为3g/L，取0.14mL（约含罂粟碱0.4mg），经30G头皮针注射于海绵体内，诱发阴茎勃起，观察30min，重点观察其阴茎勃起情况并计数，阴茎头膨胀及远端阴茎体露出为1次勃起。

四、主要试剂

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）测试盒由南京建成生物工程研究所提供。高纯总RNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术公司），PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒（大连TaKaRa宝生物工程有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM PCR试剂盒（大连TaKaRa宝生物工程有限公司）。

五、指标测定

（一）阴茎海绵体组织中氧化应激和血管内皮相关指标的测定

各组大鼠进行勃起试验后处死，取大鼠阴茎海绵体组织，按照试剂盒说明书，制成组织匀浆后备用，进行大鼠阴茎海绵体组织中氧化应激相关指标SOD水平、GSH-PX、MDA和血管内皮功能相关指标NO、eNOS含量的测定。

（二）阴茎海绵体组织中NADPH氧化酶gp91phox和p22phox亚基的mRNA表达的测定

1. 总RNA提取：取各组大鼠阴茎海绵体组织, 生理盐水冲洗干净并滤纸吸干后放于电子天平称质量（150±10）mg，放入盛有液氮的研钵体中研磨成粉末状，直接加1mL裂解液RL后匀浆, 按高纯总RNA快速提取试剂盒提取组织总RNA。取制备好的RNA，加入TE Buffer溶解后，用紫外分光光度计, 进行吸光度的测量，A260/A280为1.8～2.0。

2. 逆转录反应（RT）：取总质量500ng的总RNA, 逆转录反应体系50μL，按逆转录试剂盒说明步骤进行，5×PrimeScriptTMBuffer 10μL，PrimeScriptTMRT Enzyme MixⅠ2.5μL，Oligo dT Primer（50μmol/L）2.5μL, Random 6mers（100μmol/L）2.5μL, Total RNA（0.5 g/L）15μL，RNase Free dH2O 17.5μL。反应条件为:37℃反应30 min（反转录），85℃反应5s（变性）。

3. 聚合酶链反应(PCR)：目的基因及内参基因的引物序列: GenBank中查出引物mRNA序列号, primer5软件设计PCR引物, 以GAPDH为内参，引物序列如下: GAPDH: M17701, sense：5'-GGCACAGT CAAGGCTGAGAATG-3'；antisense：5'-ATGGTGG TGAAGACGCCAGTA-3'； gp91-phox： NM023965, sense： 5'-ACAAGGTTTATGACGATGAGCCTA-3'；antisense：5'-CACTGGCAGCAAGATCAGCA-3'；p22-phox:NM024160, sense：5'-ACCGTCTGCTTGGC CATTG-3'； antisense: 5'-TCAATGGGAGTCCACTGC TCAC-3'。目的基因扩增的条件: 均为50μL反应体系,应用GAPDH mRNA作为参照，变性条件: 95℃预变性5min, 95℃变性5s, 60℃退火20s, 72℃延伸20s, 45个循环。所有操作均参阅文献及试剂盒说明书进行。

六、统计方法

应用软件Graphpad prism 5进行统计分析并输出图片，用成组t检验对所得数据进行显著性检验。

结 果

一、大鼠阴茎勃起情况

大鼠行手术造模后8周，海绵体内注射罂粟碱，阴茎勃起情况见表1。B组大鼠的阴茎勃起次数及勃起比率明显小于A组，存在统计学差异（P＜0.01），C组所有大鼠的勃起次数均为0。上述结果说明单侧及双侧海绵体神经损伤会影响大鼠的阴茎勃起功能，手术造模成功。

表1 各实验组大鼠阴茎勃起情况（n=20，±s）

表1 各实验组大鼠阴茎勃起情况（n=20，±s）

组别 数量 阴茎勃起数量 平均勃起次数 勃起率(%) A组 20 20 2.5±0.89 100 B组 20 10 0.6±0.68 50 C组 20 0 0 0

二、大鼠阴茎海绵体组织氧化应激相关指标

假手术组、单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织SOD水平、GSH-PX活性和MDA含量见表2。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织SOD水平、GSHPX活性低于假手术组，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01）。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织MDA含量均均高于假手术组，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01）。

表2 各实验组大鼠阴茎海绵体组织SOD、GSH-PX和MDA结果（n=20，±s）

表2 各实验组大鼠阴茎海绵体组织SOD、GSH-PX和MDA结果（n=20，±s）

组别 SOD(μU/L) GSH-PX(酶活力单位) MDA(μmol/L) A 77.39±6.60 675.35±75.35 3.85±0.26 B 59.13±6.86 313.68±36.73 7.46±0.58 C 53.39±8.34 273.67±62.10 8.56±0.59

三、大鼠阴茎海绵体组织血管内皮功能相关指标

假手术组、单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织NO浓度和eNOS活力结果见表3。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织NO浓度和eNOS活力均低于假手术组，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01）。

表3 各实验组大鼠阴茎海绵体组织NO浓度和eNOS活力结果（n=20，±s）

表3 各实验组大鼠阴茎海绵体组织NO浓度和eNOS活力结果（n=20，±s）

组别 NO(nmol/mL) eNOS(nmol/min.g) A 380.74±32.42 3.92±0.51 B 285.72±50.95 2.15±0.33 C 134.73±22.91 1.74±0.40

四、NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亚基mRNA表达

根据目的基因的原始定量结果，经过管家基因校正后得到gp91phox和p22phox亚基的相对定量结果见表4。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织内NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亚基mRNA的相对表达倍数均高于假手术组，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01）。

表4 NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亚基mRNA的相对表达倍数（n=20，±s）

表4 NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亚基mRNA的相对表达倍数（n=20，±s）

组别 gp91phox亚基mRNA的 p22phox亚基mRNA的相对表达倍数 相对表达倍数A 2.85±0.25 3.01±0.42 B 10.65±1.39 14.24±1.88 C 14.96±2.69 17.87±2.44

讨 论

细胞活性氧（ROS）包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、次氯酸（HOCl）等。ROS既是细胞信号传导和基因调控的重要参与者，又是细胞代谢的有害副产物，能引起脂类、蛋白质和核酸的损伤。ROS中的O2-在ED中发挥重要作用[1]。正常情况下，细胞能通过自身的保护功能使体内的ROS保持正常水平。当体内的ROS过多时，ROS能影响一氧化氮（NO）的生成和其生物利用度，而NO在阴茎勃起过程中作为主要的神经递质起着决定性作用，从而导致ED[2]。NO与环磷酸鸟苷（cGMP）和蛋白激酶（PKG）组成了NO-cGMP-PKG通路，调控着阴茎的勃起状况。

体内抗氧化系统主要由酶促反应和非酶促反应两部分活性物质组成，体内酶促反应抗氧化的酶系SOD、CAT、GSH-PX可使活性氧转变为过氧化氢，最终转变为水和分子氧, 从而发挥清除氧自由基的作用。SOD及GSH-PX是体内非常重要的氧自由基清除剂,能保护细胞免受损伤, 其活力的高低间接反映了机体清除自由基的能力[3]。自由基损伤的主要病理机制是引起脂质过氧化，MDA是脂质过氧化的代谢产物，其水平可反映机体脂质过氧化损害程度。

本实验研究发现, 单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织SOD水平和GSH-PX活性均低于假手术组，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01）。而反映机体氧化应激损伤的指标MDA在单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组中均较假手术组显著增加，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01），确证了海绵体神经损伤大鼠的阴茎海绵体组织内氧化应激状态的存在。由此可以认为，大鼠神经性ED的发生、发展过程除了与神经损伤直接相关外，也可能与氧化应激有关。本项研究的结果对此见解提供了新的、直接的证据。

既往的研究发现，高血压、动脉粥样硬化等血管疾病中, 源于NADPH氧化酶的ROS增加，ROS是调节血管结构和功能状态的重要信号分子, 血管内皮细胞、平滑肌细胞和动脉外膜细胞等均可产生ROS, ROS过多与炎性反应、动脉粥样硬化、糖尿病、高血压和肿瘤的发生密切相关[4,5]。在病理状态下，NADPH氧化酶可以催化产生大量ROS，尤其是O2-。O2-与NO结合后形成过氧化亚硝酸盐（ONOO-）, O2-与NO反应后消耗了NO，使NO减少，影响NO-cGMPPKG通路，从而进一步影响勃起功能[6]；另外，通过该反应合成的ONOO-对阴茎海绵体平滑肌的舒张作用明显弱于NO[7]。此外，O2-和ONOO-均可以诱导内皮细胞凋亡，使eNOS合成减少，降低NO的合成，而NO的合成减少是ED发生的重要病理生理过程，同时ONOO-还能够抑制SOD的功能，降低抗氧化能力，加重氧化应激，并且NO合成的减少和过度消耗还可以增强血小板和粒细胞粘附于血管壁的内皮细胞，随后释放血栓素A2和5-羟色胺，介导血管收缩[1]。

NADPH氧化酶最初在吞噬细胞中发现，由6种不同的亚基组成，分别为催化亚基gp91phox，调节亚基p22phox、p47phox、p67phox和p40phox，小G蛋白Rac也参与组成NADPH氧化酶[8]，其中gp91phox和p22phox位于细胞膜上，而p47phox、p67phox、p40phox和Rac位于细胞质中。近年来，在非吞噬细胞中陆续发现了多种NADPH氧化酶的同源物，根据gp91phox的同源性形成了NOX家族[8]。NADPH氧化酶可以被内皮素-1、血管紧张素-Ⅱ等多种因子激活[9]，其中p47phox的磷酸化是NADPH氧化酶活化的关键环节[10]。p47phox多个丝氨酸位点发生磷酸化改变后，引导p47phox、p67phox和p40phox迁移到细胞膜上，与位于细胞膜上的gp91phox和p22phox结合，介导NADPH氧化酶活化[10]，其中gp91phox是其主要的功能亚单位，p22phox的C末端有一富含脯氨酸的尾巴，可能用来结合Nox的胞质激活因子，从而发挥在胞内的调节作用[11,12]。

本研究的另一个目的，就是了解NADPH氧化酶在大鼠神经性ED氧化应激损伤中的作用。本实验研究发现, 单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织内NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亚基mRNA的相对表达倍数均较假手术组明显升高，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01），促进了阴茎海绵体内氧化应激反应。同时，检测到大鼠阴茎海绵体组织内MDA增多。

本实验显示单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组大鼠的阴茎海绵体组织NO浓度均低于假手术组，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01），并且单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组大鼠阴茎海绵体组织中NADPH氧化酶的功能亚基的mRNA表达增多，可以推断源于NADPH氧化酶产生的活性氧也增多，并与NO反应, 使NO生物利用度下降, 导致阴茎海绵体内皮功能下降。此外, 在本实验研究结果中，单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组大鼠的阴茎海绵体组织eNOS活性均低于假手术组，两两比较均存在统计学差异（P＜0.01）。由这些结果可以认为，阴茎海绵体内血管内皮细胞在受到勃起神经损伤等危险因子刺激时，NADPH氧化酶的活性增强, 源自NADPH氧化酶的活性氧产生增多，包括超氧阴离子、过氧化亚硝基等产生增加，可改变细胞内的氧化-还原状态,引起一系列的eNOS脱偶联与活性氧产生增多的恶性循环, 最终结果导致NO生物利用度进一步降低[13]，从而影响到阴茎勃起功能。

综上所述，基于本研究结果, 我们认为在大鼠海绵体神经损伤致阴茎勃起功能障碍的过程中，除了本身神经损伤以外，阴茎海绵体组织的氧化应激以及NADPH氧化酶相关的阴茎海绵体血管内皮损伤也是大鼠神经性ED的发生、发展的重要机制之一。

1 Agarwal A, Nandipati KC, Sharma RK,et al. Role of oxidative stress in the pathophysiological mechanism of erectile dysfunction. J Androl 2006; 27(3): 335-347

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（2014-04-15收稿）

Oxidative stress status in corpus cavernosum tissue of neurogenic erectile dysfunction rats*

Shen Hanjian, Zhu Guangyou**, Shen Yan, Wang Feixiang, Weng Shaozheng Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Shanghai 200063, China

Zhu Guangyou, E-mail: zhugy@ssfjd.com.cn

ObjectiveTo investigate oxidative stress status in corpus cavernosum tissue of neurogenic erectile dysfunction rats.MethodsTotal of 60 male SD rats were divided them into three groupsincluding Group A (sham operated group); Group B(ratswith one side of Cavernous nerve transection; Group C( rats both sides of Cavernous nerve transection). At the 8th weeks after surgery, rats received erectile function test and then were executed. Corpus cavernosum tissues of rats were collected. The levels of Superoxide Dismutase (SOD), Malondialdehyde (MDA), Nitric Oxide (NO), vitality of Glutathione Peroxidase (GSH-PX) and Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS), and expression of NADPH oxidasesubunits gp91phox and p22phox in corpus cavernosum tisues were measured.ResultsSOD level and vitality of GSH-PX in Group B and C were lower, than those in Group Awhereas level of MDA was higher. Also, the level of NO and vitality of eNOS in Group B and C were lower than those in Group A, but expressions of NADPH oxidase subunits gp91phox and p22phox were increased as compared with those of shamed operated group.ConclusionTheses results suggest that apart from nerve injury, oxidative stress of corpus cavernosum tissue and NADPH oxidase related Corpus cavernosum endothelial damage may also be major triggers for neurogenic erectile dysfunction of rats.

neurogenic erectile dysfunction; oxidative stress; NADPH oxidase

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.004

R 698.1

资助: 本课题获司法部司法鉴定科学技术研究所所级基金资助（编号：2010-1）
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, E-mail: zhugy@ssfjd.com.cn