刘慧丽，席守民

·综述·

以葡萄糖激酶为靶点治疗2型糖尿病的实验研究进展

ProgressofExperimentalStudyonTreatmentofDiabetesMellitusType2byGlucokinaseasTarget

刘慧丽，席守民

目的探讨以葡萄糖激酶为靶点治疗2型糖尿病药物的研究现状。方法参阅国内外发表的相关文献，综述葡萄糖激酶激活剂、葡萄糖激酶调节蛋白以及突变的葡萄糖激酶基因对2型糖尿病治疗的效果及影响。结果3种方法均能不同程度地调节2型糖尿病动物的血糖水平，但其具体作用机制及其副作用有待进一步研究。结论以葡萄糖激酶为靶点来调控血糖水平可能是一种安全有效的措施。

葡萄糖激酶；激活剂；调节蛋白；葡萄糖激酶基因；2型糖尿病

目前糖尿病的发病率在全球呈上升趋势，已成为一种严重威胁人类生命健康的慢性疾病[1]。口服降糖药物如双胍类、硫脲类以及注射胰岛素治疗2型糖尿病，均不能很好地控制血糖变化，甚至经常出现低血糖状况。因此寻找一种能够有效调节血糖的方法成为近年来众多科学家的研究热点。葡萄糖激酶(glucokinase,GK)主要由肝细胞和胰腺细胞特异性分泌，其不但能够催化细胞的葡萄糖磷酸化，还能促进胰岛素分泌和加速体内葡萄糖的分解代谢，具有调控体内血糖平衡的功能。因此，以葡萄糖激酶为靶点来调控血糖水平可能是一种既安全又有效的措施[2]。

1 葡萄糖激酶激活剂

1.1葡萄糖激酶

GK又称己糖激酶IV型，分子质量52 kD，由448个氨基酸残基组成，包含一大一小两个结构域，并含有两种结合位点：一种是用以结合葡萄糖和MgATP2-，是葡萄糖分子磷酸化的活化位点；另一种是用来和小分子GK激活剂或生理性激活剂结合的变构位点。通过对GK的晶体结构分析，发现GK主要以3种构象存在: 开启型、超开启型和关闭型。当GK呈现为超开启型时，其处于非功能状态，也就是稳定状态；当GK呈关闭型时，此时GK大小结构域折叠，葡萄糖和MgATP2-同时存在并与之结合，其处于功能状态;开启型状态是GK在功能状态与非功能状态之间转换的一个过渡构象[3]。

作为葡萄糖感受器的GK，其99%在肝脏表达，受胰岛素和胰高血糖素的调控，生物活性具有血糖依赖性，其对葡萄糖的亲和力: [S]0.5(葡萄糖)=7.5 mmol/L。在肝细胞内，GK是糖酵解和糖原合成第一步反应的限速酶。当葡萄糖浓度升高时可活化GK，催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，进一步转化为6-磷酸果糖参加后续糖酵解反应，生成乳酸或进入三羧酸循环，或者转化为1-磷酸葡萄糖，促进糖原合成及贮存。GK主要作用是通过增加肝脏对葡萄糖的利用和增强胰岛素分泌两条途径来降低血糖，在血糖稳态的维持过程中发挥重要作用[4]。

1.2葡萄糖激酶活性改变

GK作为一个关键酶在2型糖尿病动物模型研究中具有重要意义。Seoane等[5]发现自发性糖尿病模型ZDF(Zucker Diabetic Fatty，ZDF)鼠肝脏细胞中GK活性比正常组下降了40%，糖原合成速度和糖原含量均低于正常组；用含有GK基因的腺病毒转染ZDF鼠使其GK过度表达，再对动物的糖代谢进行检测发现，ZDF鼠的糖代谢恢复正常。改用Wistar大鼠作模型动物，同样用腺病毒转染的方法使GK过度表达，发现糖原合成和糖酵解水平均明显增强。Shiota[6]采用高脂、高糖、低膳食纤维饲料对C57BL/6正常小鼠喂养30周形成2型糖尿病模型，并以同样饲料喂养转GK基因小鼠，研究发现转GK基因组小鼠血糖和胰岛素水平在30周时明显低于正常小鼠组，也由此推断正常组GK的活性明显低于转GK基因小鼠组。欧阳礼枝等[7]对Wistar大鼠进行高脂高热量饲料喂养数周，使其产生胰岛素抵抗，发现胰岛素抵抗组肝糖原水平降低，GK活性下降，采用免疫印迹方法检测发现正常组GK表达量明显高于胰岛素抵抗组。

1.3葡萄糖激酶激活剂

近年来，有学者发现体内一些活性因子对GK有调节作用，在对GK的晶体结构进行细致分析的基础上，发现这些活性因子能够与GK的某些氨基酸残基如Lys169、Arg63、Tyr215等结合[8]，从而调节其活性。由此发现了一系列的化合物，这些化合物不仅能提高GK的活性，而且能够降低血糖水平。2003年罗氏公司Joseph等[9]通过高通量筛选并经过结构优化得到了第一个葡萄糖激酶激活剂(GKAs)RO-28-0450，此后各种与GKAs相关的文献和专利便层出不穷。到目前为止还未有GKAs药物上市，但是已有多个化合物进入Ⅰ和Ⅱ期临床试验[10]。酰胺类、苯并咪唑类、喹唑啉类、脲类、吡啶类以及肽类等是目前几种主要的GKAs[11]。

1.3.1酰胺类 酰胺类是最常用的GK激活剂。该类化合物一般都含有一个酰胺键和一个含N杂环，一方面GK的Arg63骨架上羧基O与酰胺键上NH作为氢原子的供体结合；另一方面GK的Arg63骨架上NH与含N杂环上的N作为氢原子的受体结合,从而达到激活GK的作用。2005年Alexander等[12]研究发现激活剂LY2121260可使GK的最大反应速度(Vmax)增长40%，[S]0.5(葡萄糖)由6.8 mmol/L降至0.4 mmol/L。这些数据表明LY2121260呈剂量依赖性的降低健康Wistar大鼠的血糖水平。

1.3.2苯并咪唑类 此类化合物以2-吡啶基-1H-苯并咪唑为核心，其可与GK的Arg63形成N杂环，形成的N杂环类似GK酰胺类激活剂的氢键。Keijt等[13]研究发现化合物Compound3g的半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)为0.16 μmol/L(2.5 mmol/L葡萄糖),1 mg/kg即可有效地降低健康Wistar大鼠的血糖水平。Makoto等[14]研究发现化合物Compound16p(R)的EC50为0.36 μmol/L (1.1 mmol/L葡萄糖)，口服Compound16p(R)(3 mg/kg)可有效改善Wistar大鼠的口服葡萄糖耐量。

1.3.3喹唑啉类 这类衍生物可与GK的Arg63相结合。由Tomoharu等[15]研究发现的衍生物Compound21d具有很好的激活GK作用，此衍生物的EC50为0.14 μmol/L(2.9 mmol/L葡萄糖)，对高脂饲料喂养的小鼠口服Compound21d (10 mg/kg)，发现其血糖水平明显降低。

1.3.4脲类 以非手性氮原子替代酰胺类化合物中1位的手性α碳原子形成一系列脲素类衍生物。最常见是Urea26和Urea30，Arlindo等[16]发现，当葡萄糖浓度为5 mmol/L时Urea26的EC50为6.6 μmol/L，其对GK的最大激活倍数为3.3；而Urea30的EC50为11.5 μmol/L，最大激活倍数为3.8。采用C57BL/6J小鼠分别进行口服Urea26和Urea30各100 mg/kg,结果发现口服Urea26组血糖降低34%,而口服Urea30组血糖降低22%，血糖降低幅度均高于正常对照组。

1.3.5吡啶类 吡啶类化合物能够有效的激活GK，此类化合物由Array Biopharma公司合成。其中化合物Array-403由Thomas等[17,18]研究发现，当其浓度为5 mmol/L时GK的最大反应速率(Vmax)为正常对照组的134%，[S]0.5(葡萄糖)为0.93 mmol/L。给C57BL/6J小鼠分别口服3、10、30 mg/kg的Array-403，发现各组血糖水平也相应降低，且与葡萄糖浓度有很大关系，对其进行继续观察发现小鼠没有出现低血糖症状,其血脂和体质量也没有明显变化。

2 调节葡萄糖激酶活性的多种蛋白

GK的活性不仅受GKAs的影响，也受多种蛋白调节。目前发现的葡萄糖激酶调节蛋白(glucokinase regulatory protein，GKRP)、磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2(phosphofructokinase2/fructose biphosphatase2，PFK2/FBPase2)、促凋亡蛋白BAD等都影响着葡萄糖激酶的活性。

2.1葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP) GKRP是影响GK活性最重要的一种蛋白，最早发现于大鼠肝脏中。近年来在大鼠脑组织、胰腺组织中均发现有GKRP mRNA的表达[19]。Slosberg等[20]研究发现GKRP与GK结合降低了GK活性,主要原因是这种结合使GK存储于胞核,胞浆中游离GK含量大大减少，因而GK活性降低；而1-磷酸果糖的增多可使GKRP活性降低，导致大量的GK释放入胞浆,引起GK活性增强。 另一方面6-磷酸果糖增加又使GKRP活性升高并促进其与GK结合，这种不断的结合和解离形成了葡萄糖激酶调节蛋白的调节作用[21]。最重要的一点是GKRP对GK有很好的保护作用,并且不影响肝细胞内GK的活性。

2.2磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2(PFK2/FBPase2) PFK2/FBPase2能与GK结合并调节其活性。2,6-二磷酸果糖的合成和降解受PFK2的催化作用，其可激活磷酸果糖激酶-1，促进6-磷酸葡萄糖进一步合成1,6-二磷酸果糖，引起糖酵解途径加速[22]。Payne等[23]研究发现PFK2/FBPase2在肝脏中一方面可以使GK表达增强，主要通过2,6-二磷酸果糖来调控胰岛素信号通路上的AKT磷酸化；另一方面其又可以增强游离GK的活性，主要是通过结合GK从而改变了GK在胞核和胞浆中的分布比例。在胰腺里PFK2/FBPase2对GK的mRNA虽然没有任何影响，但Arden等[24]研究发现其主要是通过调控GK转录后翻译影响其活性，另外这种相互作用也增强了胰岛素的释放，从而降低了血糖水平。

2.3促凋亡蛋白(BAD) BAD由Nika等[25]研究发现，主要在肝细胞和胰腺β细胞的线粒体膜上表达，它不但能与GK形成复合物而改变GK的活性，而且还可以调节葡萄糖刺激的线粒体呼吸，胰腺β细胞功能和胰岛素分泌也可能会受到这种调节的影响。

3 葡萄糖激酶基因突变

近年来发现葡萄糖激酶基因的变异也是导致2型糖尿病发生的重要因素。对突变的葡萄糖激酶基因进行改造研究，发现其在治疗2型糖尿病的过程中安全有效，研究者对其将有效控制血糖、最终治愈糖尿病方面抱有较大的希望。

肖梅芳等[26]通过Cre-loxP条件性基因打靶技术构建了GK基因敲除型2型糖尿病小鼠模型。其模型鼠GK表达量下降35%，而其肝糖原含量比对照组下降了60%。研究提示重组GK基因可能成为治疗2型糖尿病的方法之一。蔡梦茵等[27]为了研究2型糖尿病的发生与葡萄糖激酶基因突变的关系，选取MODY2家系成员进行取样并且提取其基因组的DNA，然后对其进行PCR扩增，并且对目的基因也就是葡萄糖激酶基因5′端、3′端非翻译区及1-10号外显子直接测序，确认突变。结果在MODY2家系中发现GK-E339K突变，该突变与糖耐量异常和糖尿病的发生有一定关系。试验显示E339K位点靠近ATP结合位点Ser336，因此E339K很可能会影响GK与ATP的结合，改变GK的活性，这为治疗2型糖尿病提供了基因理论上的基础。2010年郑泰山等[28]通过直接测序PCR产物的方法，筛查了GK基因启动子区、内含子/外显子结合区及整个编码区，结果在1个多发糖尿病家系中发现1个新的GK基因突变V5L。该突变位于肝脏特异性转录的GK基因的外显子1b处，与糖尿病的发生表现为共分离，但此突变对GK功能的具体作用机制仍需进一步研究。姚雪霞[29]运用分子动力学模拟和隐性溶剂自由能计算的方法理论研究了GK的单点突变Y214C(Tyr214→Cys)，通过分析GK的Cα原子均方根浮动变化和动态相关性矩阵，确认Y214C突变可使原本处于活化状态的GK的构象稳定性增强；通过包结自由能分析发现，Y214C突变还能够增强葡萄糖与GK的包结亲合力。Y214C活性突变的机制不仅让人们在原子水平上有了更深一步的理解,并且也为将来治愈糖尿病提供了一定的理论参考。

4 存在问题

GKAs主要以肝细胞和胰腺细胞内的GK为靶点，通过改变GK的Vmax或葡萄糖的亲和力([S]0.5)调节GK活性，具有促进葡萄糖代谢和葡萄糖刺激胰岛素分泌的双重作用。目前已发现的GKAs均能很好地改善动物模型的血糖，但是对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响大多还停留于细胞实验的结果，对于动物体内的实验结果报道较少。而GKAs促进胰岛素分泌是由于对胰岛的一种过度使用，还是因为对胰岛的保护作用，从而使其功能改善，还有待于进一步的证实。虽然Array-403已经在动物实验中明确不会引起低血糖，对肝功能和血脂无不良反应，但因为GKAs的双重降糖作用以及对肝脏物质代谢的影响，这些仍是化合物研发中必须注意避免的问题。

5 展望

以葡萄糖激酶为靶点治疗2型糖尿病现在已经成为了糖尿病研究的热点之一。但不论是研究出更多新型的抗糖尿病药物，如葡萄糖激酶激活剂，还是增强葡萄糖激酶的活性调控，又或者是通过对突变的葡萄糖激酶基因进行改造，都要建立在安全、有效、长久的基础上，尽可能地去造福于人类。

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2014-04-14

河南科技大学医学院，河南洛阳 471003

刘慧丽(1986-)，女，河南洛阳人，在读硕士研究生，从事疾病的分子机制研究。 通信作者：席守民，男，副教授，硕士生导师，E-mail: xishoumin1968@163.com

R587.1

B

1672-688X(2014)04-0317-04