刘亚举，孙现锋

IDproofMixture软件包在STR分析和法医生物统计中应用

ApplicationofIDproofMixtureSoftwarePackagetoSTRAnalysisandForensicBiologicalStatistics

刘亚举1，孙现锋2

目的探讨IDproof Mixture软件包在DNA个体识别数据分析中的应用。方法采用AB 3130XL型测序仪电泳PCR产物，使用IDproof Mixture软件包进行STR片段分析和计算似然比率(likelihood ratio，LR)或随机匹配概率(probability of random match，Pm)。结果该软件包不仅能对STR电泳数据进行分析判型，而且能进行DNA识别数据的分析。结论IDproof Mixture软件包操作简单，兼具判型、统计计算和混合斑分析功能，在法医DNA检验中有重要意义。

STR片段分析；个体识别；混合斑分析；法庭生物统计

在法医DNA检验过程中，STR电泳获得的原始数据，一般先要用GeneMapper软件进行分析判型。然后再用专门的软件或人工计算似然率(likelihood ratio,LR)，亲权指数(paternity index,PI)等证据强度指标。其间涉及的数据转移、格式转换等，不仅增加操作量，而且增加出错机会。本文介绍的IDproof Mixture Software是一款多功能的STR分析工具，该软件不仅具有批量数据处理、质量报告生成、STR判型、图谱显示等基础功能，还可以进行同一性比对，混合斑分析等DNA分型结果的统计计算。该软件支持国内市场上多种PCR扩增试剂盒，兼容AB3130或3500系列测序仪电泳数据。该软件具有界面友好、操作简便、结果清晰、自动化等优点。使用者可访问www.qiagen.com/IDproofMixture自由下载，但免费版的功能和使用期限会受到一定限制。

1 软件的启动与设置

下载后，点击Desktop进行安装，安装后打开桌面IDproof Mixture Software，从菜单栏Window模块Preference中的 Licensing注册，注册后自动生成Admin(管理员)和Default(实验室主任)两个角色。然后用管理员角色登录，一方面可以从菜单栏Security模块User View中建立其他角色，如技术主管、实验室人员等，并设定角色的权限；另一方面通过Reference Data模块对以下项目进行添加、删除、更改等设置：①Markers(基因座)；②Test Kits(扩增试剂盒)；③Size Standards(片段分析标准)；④Populations(人群)，打开Populations后，在Population Manager中选择Chinese(Han)进行编辑，可以对Frequencies设定，在Source框内描述参考文献的来源等。对该软件的日常使用，则以管理员外的其他角色登录，本文的介绍是以Default角色登录进入(软件窗口下方的状态栏可以显示)。

2 软件的使用介绍

法医DNA提取、PCR扩增、电泳检测等已形成完整成熟的技术检验体系，而下游DNA数据的分析统计及信息挖掘还有很大的潜在空间。IDproof Mixture Software能够兼容多种形式的电泳检测数据，本文主要叙述fsa或hid数据形式的分析应用，其中以嫌疑人(男)和受害人(女)的2人混合STR分析演示软件的使用过程。

2.1STR片段分析

首先，建立STR片段分析结果的保存文件夹。打开软件，在File列表中点击New，选择New Examination，在出现的对话框中，填写Number(命名根据自己的习惯)，点击Finish。

第2步，AB系列测序仪电泳数据的导入与分析。在已打开的软件中，点击工具栏+符号(Open Workspace)，在主界面左侧出现上述新建的文件夹，在该文件夹中点击Sample(颜色变暗)。从Operations列表中点击Import，选择Import Raw Data form files，在出现的对话框中，点击AB FSA/HID，按下Next；在Properties区域，点击Add Files，找到原始数据保存路径，选择电泳数据(结合键盘Shift或Ctrl键)，按下Open，数据就出现在下方窗口，点击需要修改的数据(颜色变暗)，可以在窗口上方的Sample type、Size standard、Test kit等选项进行设置，设置后点击Apply to selection，其中的Analysis method默认为EasyRead(点击Edit，可对一些参数设置)；按Finish，再按Yes，最后按OK即可,先对等位基因分型标准物Ladder分析，然后是阳、阴性对照，最后是检测样本，分析结果存于 Sample文件夹内。

在分析过程中，首先数据的处理从3个方面进行：①原始数据处理Raw Data Analysis：确定分析范围Auto-Range，使峰形图更加光滑smooth，起点统一到原始点Baseline substraction，删除连带的峰pull-up Correction，去掉毛刺Spike Removal；②Size call：主要是进行由时间到碱基长度的转化；③Allele call：选择分析范围，设置峰的强度范围50～30 000。最后进行：①自动校正Panel，自动挑选最合适的Ladder；②选择阴阳性对照；③Allele Peak分数阈值；④混合样本判断阈值。分析结束后，将显示并总结导入数据的分析结果，点击show analysis summary 即可看到分析总结，其中√表示质量很好；﹗表示结果可以接受，但需要查看一下；√√表示质量好，质控标准达到了，但是Size standard 被修改过。

第3步，STR数据的核查对照。打开Sample文件夹，选择某一样品原始数据，从菜单栏Electropherogram中，点击Electropherogram，窗口会展示峰形图和分型结果。如果检测到stutter峰、shoulder峰、off-ladder、off-scale、3-band patterns或者overlap过高过宽峰，即显示。同样可以进行Size Calling Regression和Panel Representation操作，还可利用工具栏项目对分型图进行处理。

2.2法医生物统计计算

2.2.1DNA数据的同一性比对 主要有3种情况：①现场生物检材DNA与嫌疑人DNA的同一性比对；②通过查找DNA数据库，比对与现场生物检材DNA吻合的个体；③2份现场生物检材来自同一个体的比对，日常工作中一般利用繁琐的人工方法计算似然比率或随机匹配概率。打开Sample文件夹，选择某一样品原始数据，从菜单栏Operations中，点击Biostatistics，按ID Probability，选择alleles作为计算的标准点击Next，选择种族人群基因频率用来计算分型概率，点击Finish，显示计算结果，如Genotype Frequency、Ratio、Probability，结果存于 Probability of Identity 文件夹内。

2.2.2混合斑的个体识别 男女血细胞[1]、混合上皮细胞[2]等单细胞分离检验技术在基层DNA实验室还没有普及，检出完整混合STR分型时检材已耗尽，无法进入DNA数据库，遇到重大疑难案件依靠专家建立数学模型进行解释[3-4]或拆分[5]输入DNA数据库比对，还有就是通过计算峰面积推断出供者STR分型图谱，但是其过程复杂，结论也很难确定，往往只能给出模糊结论，这样就大大降低了现场检材的应用价值。打开Sample文件夹，选择某一混合样品原始数据，从菜单栏Operations中，点击Biostatistics，按Likelihood Ratio(LR，似然比率)，混合样本显示在分析窗口，选择种族人群基因频率用来计算LR，按OK和Next，对话框Available Elements区域包含所有的参照样本，可以点击Fixed、Reference拖拽到Fixed Elements和Reference Elements区域，然后点击Finish，显示LR计算结果，并存于 Likelihood Ratio文件夹内。同样可以进行Random Man Not Excluded(RMNE)操作，结果存于相应的文件夹内。无论是STR分析，还是统计计算，结果可以导出或输出。选择Sample(或LR、RMNE)文件夹内原始数据，从菜单栏Operations中，点击Export或Reports即可进行操作。

3 讨论

目前国内DNA实验室使用似然比率或随机匹配概率进行单一来源生物检材的描述，包括从DNA数据库查找嫌疑人的同一认定、现场生物检材与嫌疑人比对样本的同一认定、2份现场生物检材来自同一个体的比对认定，方法科学合理、比较成熟，也是IDproof Mixture软件Biostatistics模块ID Probability的功能。本文所探讨的混合斑是指2人份混合样本类型，包括：两个嫌疑人、嫌疑人与一无名氏、嫌疑人与受害人样本的混合，是工作中最为常见的情况，而鉴定意见只是简单地描述为“包含有某某和某某的DNA分型(谱带、峰谱)”，缺少统计学的分析说明。因此，IDproof Mixture软件弥补了这方面的不足，其就是利用构建的混合斑及参照样本的模型，计算个体包含在混合斑中的似然比率，从而解释个体就是嫌犯提供科学依据。随着鉴定人出庭制度的完善，法官或律师将会对法医DNA鉴定意见的依据进行质询，而此款软件的出现，能够为DNA技术员带来许多便利，满足实际工作需要。

另外，此款软件解决了“人与物、物与物”的DNA统计计算，也是混合样品分析的杰出软件；而其姊妹软件IDproof Software是亲缘关系分析和人群遗传分析软件，可以解决“人与人”的DNA统计计算，主要应用是：亲缘关系分析(包括亲缘关系比对、亲缘关系中不相符等位基因的关联查询、三联体分析)和亲子鉴定(失踪人员认定、同源同胞关系比对)。这两款软件的功能涵盖了法医DNA检验的后续工作(即人和物、物和物、人和人等比对的统计计算)，对法医检材STR数据和亲缘关系鉴定样本进行智能分析，联合应用会极大地解决DNA检验者所面临的问题。总之，这两款软件与市售测序仪输出数据全部兼容，能够进行原始数据分析、生物统计评估、亲属关系分析和人种(群)研究、混合样本分析，并能编辑模板和输出报告。

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[2]黄江平，李彩霞，亓冰，等.单细胞检验技术用于混合上皮细胞的分离和检验[J].中国法医学杂志，2011,26(1)：39-40.

[3]康艳荣，李万水，张国臣，等.图挖掘在DNA混合样本拆分中的应用[J].江南大学学报：自然科学版，2010,9(2)：210-212.

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[5]苑美青，李万水，康艳荣，等.混合样本拆分查询犯罪嫌疑人的应用研究[J].刑事技术，2012,6：5-7.

2014-10-07

1.许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南许昌 461000 2.禹州市公安局刑侦大队，河南禹州 461670

刘亚举(1978-)，男，河南襄城人，副主任法医师，从事DNA检验及法医遗传学统计工作。

DF795.2

B

1672-688X(2014)04-0304-03