姜辰 韩园 唐娟娟 刘文涛 张广钦

以吗啡为代表的阿片类药物具有强效的镇痛作用，是临床上治疗重度疼痛的重要药物，但是多次给药以后，其镇痛作用极易耐受，这显著抑制了阿片类药物的有效使用。吗啡耐受的机制尚不明确，以往认为吗啡耐受主要是由神经元机制所介导。最近的证据表明，胶质细胞的活化，尤其是小胶质细胞的活化，在吗啡的耐受过程中同样起着重要作用。活化的小胶质细胞分泌大量炎症因子，如白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，敏化脊髓背角的神经元进而大大减弱了吗啡的镇痛作用[1,2]。

核因子κB(NF-κB)广泛存在于真核细胞，是一多功能的核转录因子，它参与免疫应答、炎症反应、调控细胞的增殖与凋亡[3]。NF-κB核转位后，会促进免疫细胞炎症因子生成增多。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一种抗氧化剂，它是NF-κB特异性的抑制剂，主要通过抑制NF-κB P65亚单位，或抑制IκB的降解，减少NF-κB的核移位来抑制NF-κB的活性。

最近有文献报道，吗啡耐受模型中，脊髓背角中的小胶作者单位：211198 中国药科大学临床药学教研室(姜辰 张广钦)；徐州医学院，江苏省麻醉学重点实验室(韩园)；南京中医药大学，生理学教研室(唐娟娟);南京医科大学，江苏省神经退行性疾病重点实验室(刘文涛)

质细胞伴随着NF-κB核转位的增多现象，提示小胶质细胞中的NF-κB可能参与吗啡耐受进程。但是抑制NF-κB能否减轻吗啡导致的小胶质细胞活化缺少直接证据。作者应用实时定量PCR方法检测吗啡对BV-2细胞前炎症因子mRNA水平的影响，并给予NF-κB特异性的抑制剂-PDTC进行干预，考察PDTC对吗啡引起BV-2细胞炎症因子合成的影响。

1 材料

1.1药物 吗啡，沈阳第一制药厂，东北制药集团公司(中国)。PDTC，sigma(美国)。

1.2细胞BV-2小鼠源小胶质细胞，购自上海中国科学院。

1.3仪器 7300 Real-time PCR 系统(Applied Biosystems, Warrington, 英国)。

2 方法与结果

2.2细胞培养 BV-2细胞在5%CO2和95%O237℃潮湿环境含10%胎牛血清(Hyclone, USA)和1%青链霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培养。实验前24 h，将培养基换成0.5%胎牛血清高糖DMEM。

2.3PDTC对吗啡诱导的BV-2细胞炎症因子释放的影响 实验采用实时定量PCR检测mRNA水平。具体方法如下：BV-2细胞随机分为对照组、吗啡模型组、吗啡PDTC治疗组和PDTC组。模型组吗啡200μM培养6 h；PDTC治疗组采用PDTC 30μM在吗啡前30 min预给药，与吗啡共培养6 h；PDTC组给予PDTC 30μM培养6 h。培养的细胞应用Trizol法抽提各组细胞RNA，Real-time PCR应用7300 Real-time PCR 系统。表1中列出特异性IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH引物序列。实时PCR实验方案如下：95℃ 10 min，40个循环：60℃ 60s，95℃ 15 s，溶解曲线60～90℃保证扩增为单一产物。以Ct值进行结果分析，采用相对量法与内参GAPDH比较。计算公式为：2-ΔCT, Δ Ct=Ct gene-Ct control。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH mRNA实时PCR引物序列

结果可见，与对照组比较，BV-2细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平均可被吗啡处理诱导升高(P< 0.01，见图1、图2、图3)，PDTC显著抑制了这一升高(P< 0.05，见图1、图2、图3)，并且PDTC基础给药不影响BV-2细胞炎症因子mRNA水平(P> 0.05，见图1、图2、图3)。结果表明，PDTC能抑制吗啡诱导的小胶质细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的合成。

注：***P<0.01与未处理对照组比较，#P< 0.05与吗啡造模组比较

注：**P<0.01与未处理对照组比较，#P< 0.05与吗啡造模组比较

注：**P<0.01与未处理对照组比较，##P<0.01与吗啡造模组比较

3 讨论

在这篇研究中，作者发现吗啡可以在体外直接导致小胶质细胞系BV-2细胞的IL-1β、IL-6和TNF-α合成增多，并且PDTC可以显著抑制吗啡导致炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α合成增多。

脊髓小胶质细胞活化在吗啡耐受的发展中起着重要作用。吗啡处理能诱导脊髓小胶质的显著活化，强烈活化的小胶质细胞能分泌大量促炎症细胞因子和炎症趋化因子，例如IL-1β、IL-6和TNF-α，这些最终调节脊髓突触传递，导致背角神经元兴奋性的增加；另一方面，神经元的兴奋性增高，可以通过释放NO、兴奋性氨基酸，如谷氨酸等，进一步活化周围的小胶质和星形胶质细胞形成正反馈，进而导致强烈持久的神经炎症[4,5]。研究发现，鞘内注射米诺环素(小胶质细胞抑制剂)或抑制炎症细胞因子的释放均能显著抑制吗啡耐受的发展，增强吗啡镇痛作用。因此控制小胶质细胞的活化和炎症因子的生成具有重要意义。

NF-κB是小胶质细胞内一类重要的转录调节因子[6]。在细胞应激等条件，NF-κB由IKKβ等激活而发生核转位，进而诱导促炎细胞因子(尤其是IL-1β)合成。作者首次证实：NF-κB抑制剂PDTC可显著减少吗啡诱导的炎症因子的生成，这一研究提示：PDTC可能对于增强吗啡镇痛作用具有积极作用，但是关于PDTC改善吗啡镇痛作用的详细分子机制，仍需更深层次的研究和探讨。

综上所述，本文证实了PDTC能通过抑制NF-κB核转位显著降低吗啡导致的小胶质细胞炎症因子合成。该研究可能为减少阿片类药物的副反应，增强镇痛效果提供新的思路和靶标。

[1] F. Ferrini, T. Trang, T.A. Mattioli, et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl(-) homeostasis. Nat Neurosci, 2013(16):183-192.

[2] T. Berta, T. Liu, Y.C. Liu, et al. Acute morphine activates satellite glial cells and up-regulates IL-1beta in dorsal root ganglia in mice via matrix metalloprotease-9. Mol Pain, 2012(8):18.

[3] Aggarwal BB. Nuclear factor-kappaB: the enemy within. Cancer Cell, 2004(6):203-208.

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[5] Sun J, Liu S, Mata M, et al. Transgene-mediated expression of tumor necrosis factor soluble receptor attenuates morphine tolerance in rats. Gene therapy, 2012(19):101-108.

[6] Rius J, Guma M, Schachtrup C, et al. NF-kappaB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1alpha. Nature, 2008(453):807-811.