类透明质酸壳聚糖微乳增加大鼠血肿瘤屏障通透性的研究

2014-03-21解辉陆威成丁晓慧杨智航杨志强薛一雪

中国医科大学学报 2014年8期

解辉，陆威成，丁晓慧，杨智航，杨志强，薛一雪

（1.沈阳医学院组织胚胎学教研室，沈阳110034；2.中国医科大学附属第一医院神经外科，沈阳110001；3.沈阳医学院生理学教研室，沈阳110034；4.沈阳医学院2013级临床医学专业2班，沈阳110034，5.中国医科大学神经生物学教研室，沈阳110001）

解辉1，陆威成2，丁晓慧1，杨智航3，杨志强4，薛一雪5

目的研究类透明质酸壳聚糖微乳（（HAC⁃ME）对脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障（BTB）通透性的作用效果及机制。方法采用伊文氏兰（EB）渗透评估HAC⁃ME作用后BTB通透性的变化。应用Western blot方法观察HAC⁃ME作用后大鼠脑胶质瘤微血管中紧密连接相关蛋白（Claudin）⁃5的表达情况。结果EB渗透评估结果表明HAC⁃ME（＜5 mg/mL）可引起脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性发生变化，灌注0.25 h后血肿瘤屏障通透性开始增加，灌注1 h时达高峰，而后有所下降，16 h时基本恢复至灌注前水平，同时Western blot结果表明大鼠脑胶质瘤微血管中Claudin⁃5蛋白的表达水平，从HAC⁃ME作用后0.25 h后开始减少，作用后1 h表达最少，而后有所上升，16 h时基本恢复至作用前水平。结论HAC⁃ME能够增加脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障的通透性，其作用机制与Claudin⁃5表达水平下调相关。

类透明质酸壳聚糖微乳；血肿瘤屏障；紧密连接

透明质酸是大分子直链糖胺多糖，由重复的二糖单元组成，其广泛存在于生物体内，不仅作为一种主要的结缔组织细胞外基质成分，同时也是一种生物调节分子，具有多种生物学活性。壳聚糖是一种天然的高分子阳离子集合物，具有良好的生物可降解性及生物相容性，成为药物载体的研究热点［1］。微乳是目前研究极其广泛的新型药物载体系统［2］，其具有血脑屏障（blood⁃brain barrier，BBB）开放作用，但由于微乳进入血液循环后易被网状内皮系统巨噬细胞吞噬，从而限制了其向脑部的选择性分布，故脑靶向性不强［3～5］。已经有研究者将透明质酸、壳聚糖和微乳进行组装，成功制备了类透明质酸壳聚糖微乳（HAC⁃ME），其亲水性增加，并抑制了巨噬细胞的吞噬作用，提高了脑靶向性。研究发现大部分实体肿瘤组织外周的透明质酸增高，然而透明质酸易为机体代谢，留存时间短［6，7］，同时肿瘤细胞表面的透明质酸受体CD44表达上调［8～11］，研究已经证实在人脑胶质瘤及大鼠C6来源的胶质瘤中均存在CD44分子的表达［12，13］，这提示透明质酸与细胞表面的CD44受体结合而参与调解肿瘤细胞的生长、转移等，利用透明质酸/CD44受体介导作用可以提高抗肿瘤药物的主动靶向性［14，15］。因此，我们推测外源性HAC⁃ME具有开放BTB的潜能。

本研究应用HAC⁃ME灌注脑胶质瘤大鼠，测定大鼠BTB通透性的变化，同时检测大鼠脑胶质瘤微血管中紧密连接相关蛋白（Claudin）⁃5的表达，明确HAC⁃ME对于大鼠血肿瘤屏障通透性的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：健康成年Wistar大鼠，体质量180～220 g，（沈阳医学院实验动物中心提供）；Cremophor EL（德国BASF公司）；Cradamol GTCC（medium⁃chain fatty acid triglyceride，英国CRODA公司）；注射用茶油（BA，龙游县田雨山茶油开发有限公司）；类透明质酸壳聚糖（hyaluronic acid chitosan，HAC，浙江新复大医药化工有限公司）；伊文氏兰（美国Fluka公司进口分装），Claudin⁃5（美国Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 HAC⁃ME的制备：取Cremophor EL，BA及Cradamol GTCC等的混合液（质量比为4.5∶1∶1）置配液容器中，加入处方量20%HAC水溶液，搅拌孵化15 min后，混合均匀得到HAC⁃ME溶液，放置过夜备用。

1.2.2 动物脑胶质瘤模型的制备：常规培养大鼠C6胶质瘤细胞系，用DMEM培养基制备浓度为1×106/μL的C6胶质瘤细胞悬液。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）将大鼠麻醉后，将大鼠头部固定在立体定位仪上，将制备好的细胞悬液10 μL用微量注射器注入头部右侧尾状核，靶点为前囟前1 mm，矢状缝旁开3 mm，深4.5 mm。肿瘤移植14 d后备用。

1.2.3 给药方法和实验分组：用10%水合氯醛麻醉肿瘤移植大鼠，经腹侧颈部正中切口分离右侧颈总动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉远端和颈总动脉的近端，用微量注射器在1 min内向颈总动脉的近端灌注HAC⁃ME，同时监测大鼠的体温和血压情况。选择HAC⁃ME灌注后0、0.25、0.5、1、2、4、8和16 h时间点进行研究。本研究将大鼠随机分为8组（n=8每组）：HAC⁃ME 0 h、HAC⁃ME 0.25 h、HAC⁃ME 0.5 h、HAC⁃ME 1 h、HAC⁃ME 2 h、HAC⁃ME 4 h、HAC⁃ME 8 h和HAC⁃ME 16 h组。

1.2.4 血肿瘤屏障通透性的测定：肿瘤细胞移植14 d后，大鼠BTB的通透性可用伊文氏兰（Evans blue，EB）的渗出量定量估计。用生理盐水配制2%EB。麻醉的大鼠经HAC⁃ME灌注，在不同作用时间点，经大鼠股静脉给予2%EB溶液作用2 h，之后暴露大鼠胸腔经左心室灌注肝素化生理盐水，直至右心耳处流出无色液体为止。大鼠经断头后沿矢状缝分离两侧大脑半球并称质量，再放入甲酰胺（1 mL/100 mg）中60℃孵育24 h。在分光光度计上测定620 nm处的吸光度值，根据用一系列稀释度EB的光密度值制作的标准曲线计算EB含量。

1.2.5 Western bolt法检测大鼠脑胶质瘤微血管中Claudin⁃5蛋白的表达：肿瘤细胞移植14 d，经HAC⁃ME灌注不同时间后，大鼠断头取脑，提取各组大鼠脑胶质瘤微血管段，匀浆离心、测定蛋白浓度；蛋白分离采用15%SDS⁃PAGE电泳，然后转印到硝酸纤维素膜上，孵育一抗Claudin⁃5（1∶500）4℃过夜；再孵育相应二抗室温作用2 h；以β⁃actin作为内对照，经ECL发光后，胶片条带用薄层扫描仪进行灰度扫描，Fluor Chem 2.0图像分析仪对条带积分光密度进行定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HAC⁃ME对BTB通透性的影响

EB渗透评估证明HAC⁃ME可引起脑胶质瘤大鼠BTB通透性发生变化，在灌注HAC⁃ME 0.25 h后BTB通透性开始增加，灌注1 h时达高峰，而后有所下降，灌注16 h时基本恢复至灌注前水平，见图1。

2.2 HAC⁃ME对大鼠脑胶质瘤微血管中Claudin⁃5蛋白表达的影响

Western blot法检测HAC⁃ME作用后大鼠脑胶质瘤微血管中Claudin⁃5蛋白表达的变化，结果显示HAC⁃ME灌注后，Claudin⁃5蛋白表达水平从0.25 h开始减少，在1 h表达最少，之后有所增加，在16 h基本恢复到灌注前水平，见图2。

3 讨论

脑胶质瘤是临床上颅内肿瘤中最常见的一种，起源于神经外胚层细胞，国内统计占颅内肿瘤的35.12%～61.10%，平均49.17%。大多数胶质瘤患者恶性程度高，侵袭性强，手术不易切除完全，术后化疗是脑胶质瘤治疗的主要手段之一，但由于血脑屏障和血肿瘤屏障的存在限制了化疗药物进入中枢神经系统，化疗疗效并不理想［16］。为了将化疗药物转运到脑肿瘤组织，选择性地增加BTB的通透性是一个理想的方法。

图1 EB实验测定HAC⁃ME作用后BTB通透性变化Fig.1 Change of HAC⁃ME on the permeability of BTB determined by EB method

图2 Western blot法检测HAC⁃ME对大鼠脑胶质瘤微血管中Claudin⁃5蛋白表达的影响Fig.2 Effect of HAC⁃ME on the protein expression of Claudin⁃5 in microvessel of rat brain glioma determined by Western blot method

BTB是存在于血液和脑肿瘤组织之间的一层屏障系统，脑肿瘤微血管内皮细胞之间的紧密连接（tight junction，TJ）是构成BTB结构和功能的基础。TJ主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白两种成分组成，其中Occludin和claudin⁃5是构成TJ的主要跨膜蛋白，是维持TJ结构和功能的重要组成部分。胞质附着蛋白Zonaoccludens家族中的ZO⁃1同样是构成TJ的一个主要蛋白，ZO⁃1可以作为连接跨膜蛋白oc⁃ cludin和claudin⁃5以及细胞骨架蛋白F⁃actin的桥梁蛋白，ZO⁃1的分布和表达的变化同样影响TJ的结构和功能［17，18］。目前，ZO⁃1、Occludin、Claudin⁃5是TJ的标志蛋白，这些蛋白的表达和分布的变化是BTB开放的途径之一。

本研究结果表明HAC⁃ME使脑胶质瘤大鼠BTB通透性发生变化，灌注HAC⁃ME0.25 h后BTB通透性开始增加，灌注1 h时达高峰，而后有所下降，16 h时基本恢复至灌注前水平，同时HAC⁃ME作用后大鼠脑胶质瘤微血管中Claudin⁃5蛋白表达发生变化，其表达从HAC⁃ME灌注0.25 h开始减少，在1 h表达最少，之后有所增加，在16 h基本恢复到灌注前水平。我们发现HAC⁃ME作用后，BTB通透性变化与脑胶质瘤微血管中Claudin⁃5蛋白表达变化同步，这些结果初步证明HAC⁃ME能够增加脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障的通透性，其机制与TJ开放的细胞旁途径相关，本研究结果可能为人脑胶质瘤的化疗提供新途径，但其具体机制还有待进一步深入研究。

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（编辑裘孝琦）

Study of Hyaluronic Acid Chitosan⁃based Microemulsion on the Permeability of Blood Tumor Barrier in Rat

XIE Hui1，LU Wei⁃cheng2，DING Xiao⁃hui1，YANG Zhi⁃hang3，YANG Zhi⁃qiang4，XUE Yi⁃xue5
（1.Department of Histology and Embryology，Shengyang Medical College，Shengyang 110034，China；2.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Physiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Class 2，Grade 2013，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；5.Department of Neurobiology，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of hyaluronic acid chitosan⁃based microemulsion（HAC⁃ME）on the permeability of blood tumor barrier（BTB）in brain glioma rat models，and explore the mechanism.MethodsThe permeability of BTB after HAC⁃ME infusion was measured by Evans blue（EB）assay.Western bolt method was used to measure the expression of tight junction protein claudin⁃5 after HAC⁃ME infusion in mi⁃crovessel of rat brain glioma.ResultsThe EB extravasation showed that HAC⁃ME could change the BTB permeability in brain glioma rats.The per⁃meability of BTB started to increase at0.25 h，reached a peak at1 h，then gradually decreased and restored to the level before administration of HAC⁃ME at 16 h.In addition，the results of Western blot showed that protein expression of Claudin⁃5 started to decrease at 0.25 h，reached the lowest at 1 h，then gradually increased and restored to the level before administration of HAC⁃ME at16 h in microvessel of rat brain glioma.ConclusionHAC⁃ME could increase the permeability of BTB in brain glioma rats，the mechanism may be related with the down⁃regulation of tight junction protein Claudin⁃5 expression.

hyaluronic acid chitosan⁃based microemulsion；blood tumor barrier；tight junction

R739.41

0258-4646（2014）08-0703-03

辽宁省科技厅博士启动基金项目（20131114）；沈阳医学院科技基金项目（20133053）

解辉（1982-），女，讲师，博士. E-mail：symcxiehui@163.com

2014-05-02

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