史丽，尹洁，马静，王娟，姜秉芬

（河北医科大学第四医院妇产科，石家庄050011）

血中可溶性白细胞分化抗原40配体对内皮细胞损伤的影响

史丽，尹洁，马静，王娟，姜秉芬

（河北医科大学第四医院妇产科，石家庄050011）

目的研究血中可溶性白细胞分化抗原40配体（sCD40L）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的损伤并探讨其发生机制。方法应用不同浓度人重组CD40L（r⁃CD40L）刺激HUVEC 24 h，建立单核细胞（THP⁃1）渗出模型，评价内皮细胞通透性。应用不同浓度r⁃CD40L刺激HUVEC 24 h，逆转录PCR技术检测HUVEC中TNF⁃αmRNA水平，观察不同浓度r⁃CD40L对内皮细胞功能的影响（以TNF⁃αmRNA水平表示）。采用ELISA法测定不同浓度r⁃CD40L刺激HUVEC后上清液中TNF⁃α蛋白水平。应用25 μg/L r⁃CD40L刺激HUVEC不同时间，流式细胞技术检测HUVEC凋亡情况。结果随着r⁃CD40L刺激浓度的增加，单核细胞透膜数逐渐升高，HUVEC中TNF⁃αmRNA表达水平逐渐升高，HUVEC上清液中TNF⁃α的浓度逐渐增加。应用25 μg/L r⁃CD40L刺激HUVEC不同时间，未诱导出细胞凋亡。结论sCD40L对脐静脉内皮细胞通透性的影响呈浓度依赖性，其机制可能是通过上调内皮细胞核内TNF⁃αmRNA表达并促进其分泌TNF⁃α实现的。sCD40L对HUVEC功能的影响明显早于细胞的凋亡。

子痫前期；可溶性白细胞分化抗原40配体；肿瘤坏死因子α；内皮细胞通透性；人脐静脉内皮细胞

子痫前期是一种以高血压、蛋白尿、水肿为主要临床表现的妊娠晚期特发性疾病。研究证明，子痫前期患者体内过度的炎性反应是导致血管内皮细胞损伤的重要因素之一［1］，而内皮细胞损伤是引起该病一系列临床症状的病理生理基础。可溶性白细胞分化抗原40（soluble cluster of differentiation 40，sCD40）/可溶性白细胞分化抗原40配体（soluble cluster of differentiation 40 ligand，sCD40L）是一对广泛分布于内皮细胞的信号系统，活化的血中sCD40L具有很强的生物活性，是导致血栓形成的重要炎性介质，可能导致内皮细胞的损伤。近年来研究发现，sCD40L在子痫前期患者血浆中明显增高，且与疾病严重程度呈正相关［2，3］，但其在子痫前期发病机制中的作用至今鲜见报道。本研究应用不同浓度人重组CD40L（recombinant CD40L，r⁃CD40L）刺激人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）来模仿子痫前期患者血浆中高水平sCD40L对内皮细胞的刺激，通过检测对内皮细胞通透性、内皮细胞功能的影响［以肿瘤坏死因子α（tu⁃mor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）mRNA水平表示］、细胞培养上清液中TNF⁃α蛋白水平以及能否诱导细胞凋亡，探讨sCD40L对内皮细胞的损伤，从而阐述sCD40L在子痫前期发病机制中的作用，以期为子痫前期的治疗寻找新的突破点。

1 材料与方法

1.1 材料

HUVEC、5氯甲基二乙酸荧光素（5⁃chlorometh⁃ylfluorescein diacetate，CMFDA）、人急性单核细胞白血病细胞株THP⁃1、胎牛血清、培基、培养皿、消化胰酶、二甲基亚砜等购自上海迪奥生物科技有限公司。r⁃CD40L购自于美国PeproTech公司；Transwell小室购自美国Corning Costar公司。TNF⁃α的引物由上海赛百盛基因技术有限公司设计合成。ELISA试剂盒购自美国R&D System公司。

1.2 HUVEC的培养及分组

将HUVEC接种在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基的培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵育箱培养。取3～4代细胞，以1×105/mL的浓度接种于6孔板中，根据r⁃CD40L的不同刺激浓度分为以下5组：0、15、25、35、45 μg/L组，刺激HUVEC 24 h。

1.3 单核细胞渗出模型的建立及内皮细胞通透性的测定

将上述应用不同浓度r⁃CD40L（0、15、25、35、45 μg/L）刺激后的HUVEC以1×105/cm2接种到Tran⁃swell小室上室，加含20%胎牛血清高糖DMEM培养基，待HUVEC融合成单层。工作液的配置：将50 μg CMFDA静置至室温，加入10 μL的二甲基亚砜，终浓度为10 mmol/L。工作液浓度为5 μmol/L，4 μL的原液加入2 mL的无血清培基。将生长状态良好的THP⁃1细胞饥饿24 h，离心并去掉上清，应用上述工作液重悬THP⁃1细胞，培养45 min后离心，PBS冲洗。去掉HUVEC融合成单层的上室中培基，将处理后的THP⁃1细胞应用无血清培基重悬后，以1× 105/孔、100 μL加入Transwell小室上室。下室加入含20%胎牛血清的培基，37℃、5%CO2孵育箱中培养3 h。计数：荧光显微镜计数下室THP⁃1细胞数，每组随机选择5个视野并求得平均值。

1.4 内皮细胞TNF⁃αmRNA表达水平的检测

将上述各组处理后的HUVEC应用逆转录PCR技术检测细胞中TNF⁃αmRNA水平。常规提取总mRNA并检测总RNA浓度及纯度，将总mRNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。TNF⁃α的上游引物为5′⁃AGCTCCAGTGGCTGAACCG⁃3′；下游引物为5′⁃CAGGGCAATGATCCCAAAGTA⁃3′，扩增片段为长度398 bp。内参为GAPDH，上游引物为5′⁃ACCAG CCCCAGCAAGAGCACAAG⁃3′，下游引物为5′⁃TTCAAGGGGTCTACATGGCAACTG⁃3′，扩增片段为长度123 bp。反应参数为95℃预变性5 min；94℃变性30 s，61℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃终末延伸5 min，扩增产物以1.6%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶成像系统进行半定量分析。重复3次取均值。TNF⁃αmRNA表达水平用TNF⁃αmRNA密度值/GAPDH mRNA密度值表示。

1.5 细胞上清液中TNF⁃α水平的检测

取上述5组刺激后HUVEC上清液以1 500 r/ min离心力离心5 min，再取上清液100 μL，应用ELISA法检测细胞上清液中TNF⁃α蛋白水平。同时每组均设相应未干预组。检测均由同一人在同一实验室按照试剂盒说明书操作。

1.6 流式细胞技术检测HUVEC凋亡

将上述刺激后各组HUVEC制备单细胞悬液，计数细胞（1～5）×106加入3 mL PBS离心5 min，去上清后加入预冷的无水乙醇，终浓度70%，4℃过夜。离心去除固定液3 mL PBS 5 min，900目筛网过滤，离心区PBS。加入1 mL碘化丙锭（PI）染料，避光孵浴30 min，上机检测凋亡细胞百分率。结果判断：在PI荧光直方图上凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体。内参对照：采用鸡血红细胞作为内参对照，观察红细胞PI荧光强度为正常二倍体细胞的35%。

1.7 统计学方法

使用SPSS 17.0统计软件进行数据处理和统计学分析，计量资料采用表示，多组间比较采用完全随机设计的方差分析，两两比较采用SNK⁃q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组THP⁃1细胞透膜数

随着r⁃CD40L刺激浓度的增加，透过Transwell小室滤膜的THP⁃1细胞数目逐渐增加，0、15、25、35、45 μg/L组分别为5.60±2.13、22.73±2.18、58.27± 5.27、101.67±9.74、149.00±7.31，各组比较差异均有统计学意义（F=138.9，P＜0.01）。见图1。

2.2 HUVEC中TNF⁃αmRNA表达水平

不同浓度r⁃CD40L刺激HUVEC 24 h后，0、15、25、35、45 μg/L组HUVEC中TNF⁃αmRNA水平分别为1.01±0.11、1.11±0.37、1.29±0.13、1.57±0.09、1.82±0.12、2.22±0.06，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 不同浓度r⁃CD40L刺激HUVEC后对THP⁃1细胞透膜个数的影响×200Fig.1 Migrated THP⁃1 cells after incubation of HUVEC conditional medium induced by r⁃CD40L×200

图2 不同浓度r⁃CD40L刺激后HUVEC中TNF⁃αmRNA表达水平Fig.2 Expressions of TNF⁃αmRNA in HUVEC after treatment with different concentrations of r⁃CD40L

2.3 HUVEC培养上清液中TNF⁃α的浓度

应用不同浓度r⁃CD40L（0、15、25、35、45 μg/L）刺激HUVEC 24 h后，随着刺激浓度的增加，内皮细胞分泌到上清液中TNF⁃α蛋白水平逐渐增加，各组间比较差异有统计学意义（F=128.74，P＜0.01）。各组中干预后与干预前比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 r⁃CD40L刺激HUVEC分泌TNF⁃α的影响Tab.2 Effect of r⁃CD40L on TNF⁃α concentration in HUVEC

2.4 r⁃CD40L刺激HUVEC的凋亡

应用25 μg/L r⁃CD40L刺激HUVEC 0、6、12、24、 48 h，均未诱导出HUVEC凋亡。见图3。

3 讨论

3.1 子痫前期患者血中sCD40L与内皮细胞通透性的关系

近年来研究证明，子痫前期患者体内过多炎性反应引起的血管内皮细胞通透性增高是导致子痫前期发病的机制之一［4］。sCD40/sCD40L是一对广泛分布于内皮细胞及激活血小板的信号系统，并可通过多种信号通路引起后续效应。CD40L是CD40的天然配体，主要表达于血小板、单核细胞、CD4+T淋巴细胞、内皮细胞等。当细胞被二磷酸腺苷、凝血酶及胶原等物质激活后，细胞表面的CD40L被切下来产生一个具有生物活性、可溶性的三聚体片段sCD40L进入血液循环。近年来的研究发现，孕妇血浆中sCD40L水平升高与子痫前期发病有关［2，3］。本研究应用不同浓度r⁃CD40L对内皮细胞的刺激来模仿子痫前期患者血浆中高水平sCD40L，利用CMF⁃DA标记的THP⁃1细胞株透膜细胞数反映内皮细胞通透性。结果显示，随着r⁃CD40L刺激浓度的升高，各组THP⁃1细胞透膜数逐渐增加，提示sCD40L能使内皮细胞的通透性增加，且呈浓度依赖性。

图3 25μg/L r⁃CD40L刺激HUVEC不同时间的细胞凋亡情况Fig.3 The apoptosis of HUVEC by 25μg/L r⁃CD40L injury for different times

3.2 sCD40L、TNF⁃α与子痫前期的关系

在子痫前期发病过程中，sCD40L可能通过以下途径介导体内炎性反应并引起内皮细胞通透性增加：体外研究已证实sCD40L可刺激巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞表达和释放基质金属蛋白酶、白细胞介素6和白细胞介素8［5～7］；通过核因子κB（nuclear factor⁃kappa B，NF⁃κB）信号通路引起下游细胞因子表达增加，如TNF⁃α。Takacs等［8］研究发现，子痫前期孕妇血浆可使培养的脐静脉内皮细胞中NF⁃κB的活化提高2.5倍。NF⁃κB对内皮细胞透性的影响可能是由NF⁃κB上调其下游炎性因子如TNF⁃α、白细胞介素1等直接增加内皮细胞通透性从而造成对内皮细胞的损伤［9］。TNF⁃α是一个具有多种生物学效应的炎性因子。在炎性与免疫反应发生发展中，TNF⁃α起着始动作用［10，11］，是细胞因子瀑布效应的关键点。在全身各种炎性反应中，TNF⁃α水平均明显升高，且与血管内皮细胞功能密切相关。既往研究表明，经TNF⁃α共培养的细胞从形态上会出现坏死、脱落，残存细胞稀疏失去正常形态、细胞间连接少进而完全坏死脱落。TNF⁃α造成内皮细胞损伤可通过减少分泌舒血管活性因子（氧化氮）、增加肾素—血管紧张素的分泌、趋化炎性细胞、促进炎性因子表达实现［12，13］。近年来研究证明，TNF⁃α在子痫前期发病中有很重要的作用，TNF⁃α的表达异常与子痫前期的发病及严重程度密切相关［14］。基于以上理论基础，我们检测了不同浓度r⁃CD40L对脐静脉内皮细胞刺激后细胞中TNF⁃αmRNA表达水平及细胞上清液中HUVEC分泌TNF⁃α的水平。结果显示，r⁃CD40L呈浓度依赖性地增加了脐静脉内皮细胞细胞上清液中TNF⁃α的表达水平，虽然TNF⁃α主要由巨噬细胞及中性粒细胞产生，但作为炎症启动子的TNF⁃α也可由内皮细胞始动分泌并参与机体炎症级联反应从而通过以上机制导致内皮细胞通透性增加并损伤；同时，r⁃CD40L呈浓度依赖性增加内皮细胞中TNF⁃αmRNA水平进而影响细胞功能。因此，我们推测sCD40L使内皮细胞通透性增高可能是通过上调内皮细胞核内TNF⁃α mRNA表达并促进其分泌TNF⁃α实现的。

3.3 sCD40L与内皮细胞的凋亡

sCD40L是否能诱导内皮细胞凋亡目前尚无报道，本研究结果提示r⁃CD40L呈浓度依赖性增加脐静脉内皮细胞中TNF⁃αmRNA及细胞上清液中TNF⁃α表达水平。TNF⁃α生物学效应是通过肿瘤坏死因子受体1而产生，其产生的信号传导途径有2条：一是fas相关蛋白死亡域介导的细胞凋亡；二是通过TNF受体相关死亡域—TNF受体相关因子激活核转录因子NF⁃κB抑制凋亡，肿瘤坏死因子受体2则通过不同于肿瘤坏死因子受体1但在某些环节可发生交叉反应的信号传导途径激活NF⁃κB，使细胞增殖分化。本实验应用流式细胞技术检测经r⁃CD40L（25 μg/L）刺激不同时间后（0、6、12、24、48 h）HUVEC凋亡情况，结果发现在48 h内r⁃CD40L并未诱导出细胞凋亡。这可能是通过产物TNF⁃α的自动调节网络完成的，也可能是由于sCD40/sCD40L信号直接激活细胞内抗凋亡基因、活化抗凋亡蛋白、抑制凋亡基因表达所致，具体机制尚需进一步研究。

总之，sCD40L能够呈浓度依赖性增加脐静脉内皮细胞的通透性，其机制可能是通过上调内皮细胞核内TNF⁃αmRNA表达并促进其分泌TNF⁃α实现的。在一些炎性疾病动物模型中，通过给予CD40/ CD40L单抗治疗后，产生了较好的抑制炎症发生、发展的效果，这为临床改善子痫前期临床症状及治疗提供了新思路。

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（编辑 陈姜）

Effect of Soluble Cluster of Differentiation 40 Ligand on the Injury in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

SHI Li，YIN Jie，MA Jing，WANG Juan，JIANG Bing⁃fen
（Department of Obstetrics and Gynecology，The Fourth Clinical Medical College，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the effect of soluble cluster of differentiation 40 ligand（sCD40L）on human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）and explore its underlying mechanisms.MethodsThe THP⁃1 leakage model was established by stimulating HUVEC with different con⁃centration of r⁃CD40L for24 hours.The permeability of endothelial cell was evaluated.The level of tumor necrosis factor⁃α（TNF⁃α）mRNA in HU⁃VEC cell was examined 24 hours after stimulation by different concentration of r⁃CD40L using RT⁃PCR technology.The concentration of TNF⁃α in supernatant was measured by ELISA.The apoptosis of HUVEC after r⁃CD40L stimulation（25 μg/L）was detected by flow.ResultsThe number of THP⁃1 has been shown to gradually increase with the concentration of r⁃CD40L.Along with the increase of r⁃CD40L concentration，TNF⁃α mRNA in HUVEC expression level increased gradually.TNF⁃αconcentration of HUVEC in supernatant gradually increased with the increase of r⁃CD40L concentration.No apoptosis was observed in HUVEC with 25 μg/L r⁃CD40L stimulation.ConclusionThe permeability of endothelial cells was depended on the concentration of sCD40L，the mechanism may rely on the induced expression of TNF⁃αmRNA and increased the secretion of TNF⁃α.The effect of sCD40L on the function of HUVEC was observed much earlier than cell apoptosis.

preeclampsia；soluble cluster of differentiation 40 ligand；tumor necrosis factor⁃α；endothelial permeability；human um⁃bilical vein endothelial cell

R714.24

A

0258-4646（2014）08-0698-05

河北省科技支撑计划（11276145）

史丽（1978-），女，主治医师，硕士. E-mail：shili11927@163.com

2014-06-08

网络出版时间：