李 毅，段蕴铀，韩志海，刘于红

(北京海军总医院，北京100048)

李辉等［1］研究证实，海水浸泡胸部开放伤可导致严重的急性肺损伤(ALI)，最终发展为多器官功能衰竭。ALI的本质是全身炎症反应在肺部的表现，主要特征是肺泡毛细血管损伤导致肺通透性增加，目前尚缺乏针对其发病机制有效的治疗措施，病死率较高［2］。地塞米松是目前治疗非心源性肺水肿的主要药物，但其对于海水浸泡胸部开放伤所致ALI的作用尚缺少相关的实验研究，治疗价值尚无定论。2010年10～12月，我们观察了地塞米松早期干预对胸部开放伤海水浸泡所致ALI的治疗作用，现分析结果并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年杂交犬16只，购自北京科宇动物养殖中心(合格证号:SCXF-京-2008，普通级)，体质量10～15 kg，雌雄各半;随机分为对照组和治疗组各8只。地塞米松磷酸钠(天津药业焦作有限公司)，伊文思蓝(上海恒源科技有限公司);血气分析仪(OMNFC型，瑞士Roche)，血清型及组织型肺泡表面活性蛋白A(SP-A)、肺泡表面活性蛋白B(SP-B)试剂盒及SP-B抗体(Rapid Bio Lab，美国)。配方海水［3］(按照国家海洋局第三海洋研究所提供的我国东南沿海海水主要成分配制，渗透压1 250～1 350 mmol/L，pH值8.20，比重1.05～1.06，温度22℃)。

1.2 实验方法

1.2.1 ALI模型建立及干预 对照组和治疗组均制作ALI 术前禁食12 h，肌肉注射氯胺酮(20 mg/kg)麻醉，术中应用地西泮(安定)肌肉注射维持。右颈部、右胸部备皮。经口腔气管插管，贴电极膜连接导线用于心电监护。分离右侧颈静脉及颈动脉置入单腔深静脉穿刺管，用于抽取动静脉血。用锐器于右胸第4肋间制成直径为0.5 cm切口使胸膜腔与大气相通，通过胸壁切口向胸腔内注入人工海水(35 mL/kg)，5 min内结束，然后封闭胸壁伤口。致伤30 min对照组于颈静脉注射生理盐水5 mL;治疗组颈静脉注射地塞米松1 mg/kg(加生理盐水配制成5 mL)。所有犬在实验6 h后给以放置胸腔闭式引流、静脉输入5%葡萄糖，继续观察4 h。

1.3 观察项目

1.3.1 动脉血气分析 分别于实验0、6、8、10 h抽取动脉血检测两组动脉血氧分压(PaO2)，计算氧合指数(PaO2/FiO2，FiO2取21%)。

1.3.2 血浆、支气管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A、SP-B水平 分别于致伤0、2、4、6、8、10 h采集静脉血，离心后取上清－20℃保存;实验10 h后行右下肺气管镜下肺泡灌洗，BALF离心后取上清－20℃保存。采用ELLS法检测外周血和BALF中SP-A、SP-B含量。

1.3.4 血管外肺水含量指数(伊文思蓝漏出指数，EVL-WI) 采用质量法。所有犬于实验10 h后处死后，迅速开胸，结扎肺门;取下右上肺并剪成两半(接扎切口防止液体流出)，各称湿质量;一半肺即刻剪碎;按1 mL/100 mg组织加入生理盐水匀浆，分别测血液和匀浆中Hb含量，剩余组织匀浆迅速置于－70℃保存备用;另一半肺置于80℃烘箱内干燥72 h至恒质量，称肺干质量;计算公式:总肺水量指数(TLW)=(肺湿质量－肺干质量)/肺湿质量;每克湿肺含残血量=(匀浆液Hb/血液Hb)×匀浆总样本量×1.055/匀浆肺质量;湿肺含残血量=肺湿质量×每克湿肺含残血量，EVL-WI=(肺湿质量－肺干质量－湿肺含残血量)/肺湿质量。

1.3.4 肺微血管通透性 用药结束后经股静脉注射1%伊文思蓝20 mg/kg，20 min后抽血检测血中Evans Blue含量。开胸取右肺上叶后经肺动脉插入的针头，以等渗盐水灌洗肺微血管至肺静脉无血性液体流出为止，然后置于80℃烤箱72 h至恒质量，取少量干肺称重，按3 mL/100 mg干肺加入甲酰胺，37℃孵育48 h，使蓝染的标本退色。1 500 r/min离心5 min分离上清，上清及抗凝血分别置721分光光度计620 nm波长处比色，根据标准曲线获得肺组织和血中伊文思蓝含量。用伊文思蓝漏出指数(ELI)表示肺微血管通透性。ELI=肺组织伊文思蓝含量/(肺干重×血液伊文思蓝含量)。

1.3.5 肺组织SP-B蛋白表达 采用免疫组化法。组织切片脱蜡，依次经3%过氧化氢溶液封闭，胃蛋白酶抗原修复，山羊血清封闭，逐步加入SP-B抗体及二抗，最后经DAB溶液显色。胞质有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。每组随机抽取染色清晰的切片3张，每张切片于光镜下(×200)随机选取5个视野，固定窗口面积，利用图像分析系统软件测定SP-B蛋白表达的灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，数据以s表示，两组组间数据比较采用单因素方差分析或t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉血气 致伤后出现急性呼吸窘迫表现，PaO2显著降低，致伤6 h后两组 PaO2/FiO2均 ＜300，符合ALI诊断标准。治疗组在实验第8、10 h PaO2明显高于对照组(P均＜0.01)。见表1。

2.2 血清及BALF中SP-A、SP-B含量 治疗组及对照组BALF中SP-A含量分别为24.076±6.845、16.201±7.687，P＜0.05;SP-B含量分别为31.785 ±8.576、19.472±6.865，P＜0.01。两组不同时点血清SP-A、SP-B含量比较见表2。

表1 两组动脉血PaO2及PaO2/FiO2变化(s)

表1 两组动脉血PaO2及PaO2/FiO2变化(s)

注:两组同一时间点比较，☆P＜0.01

组别 n PaO2(mmHg) PaO2/FiO2对照组8 0 h 90.4±5.6 430.5±26.8 6 h 57.4±6.2 273.4±29.6 8 h 65.4±5.1☆ 311.6±24.5☆10 h 63.5±6.9☆ 301.1±33.7☆治疗组 8 0 h 88.9±3.6 423.4±17.2 6 h 55.7±2.7 265.3±13.6 8 h 74.5±4.8☆ 354.6±23.0☆10 h 76.8±8.2☆ 359.8±33.3☆

表2 两组各时间点血清SP-A、SP-B含量(灰度值，s)

表2 两组各时间点血清SP-A、SP-B含量(灰度值，s)

注:与对照组比较，☆P＜0.05;★P＜0.01

组别 n SP-A SP-B对照组8 0 h 20.883±3.755 20.863±5.025 2 h 22.872±4.112 22.020±3.734 4 h 29.981±3.538 24.488±3.550 6 h 35.905±9.622 33.761±8.054☆8 h 40.535±7.994☆ 36.021±7.980☆10 h 43.483±8.069★ 36.686±4.614★治疗组 8 0 h 21.308±3.312 18.423±5.241 2 h 23.321±2.719 21.443±4.150 4 h 26.809±1.992 22.634±4.784 6 h 30.102±3.089 26.386±2.198☆8 h 32.168±2.926☆ 28.186±3.913☆10 h 33.677±4.643★ 27.146±4.640★

2.3 EVL-WI及ELI治疗组及对照组EVL-WI分别为0.502±0.074和0.601±0.814，P＜0.05;ELI分别为0.212±0.059、0.399±0.081，P＜0.01。

2.4 肺组织SP-B蛋白表达 与治疗组比较，对照组肺内阳性Ⅱ型肺泡上皮细胞数量明显减少，棕黄色染色变浅，SP-B蛋白表达减弱。对照组及治疗组SP-B蛋白表达分别为13 264.964±2 386.421，37 525.401±2 814.235，P＜0.05。

3 讨论

对于淹溺后早期使用糖皮质激素的益处已有所报道［4］。丁新民等［5，6］的研究也表明糖皮质激素在海水淹溺致急性肺损伤中可以明显改善淹溺兔的缺氧及肺水肿状态，并抑制兔肺组织的炎症反应。但地塞米松对胸部开放伤后海水浸泡致ALI的作用尚未见报道。与一般ALI的不同，胸部开放伤后海水浸泡致ALI除了会出现严重的低氧血症外，还会引起电解质紊乱、高渗性脱水、酸中毒等多种病理生理改变，引发全身炎症反应，最后出现多器官功能衰竭［7，8］。地塞米松作为一种简单、有效的抗炎药物，研究其在胸部开放伤后海水浸泡致ALI中的作用具有重要意义。

PS系统存在于正常肺泡表面，由肺泡Ⅱ型上皮细胞产生。正常情况下，PS由较多脂质及少量蛋白质构成。PS中的蛋白质成分又称为表面活性物质相关蛋白(SP)，包括A、B、C、D四种成分，主要以大聚集体的形式存在。在正常的肺呼吸过程中，作为存在于肺泡液气界面的一种媒介，PS可降低肺泡的表面张力，维持大小肺泡的相对稳定，防止小肺泡萎陷及大肺泡的过度膨胀;对于维持肺内正常的通气血流比值和正常肺换气起着非常重要的作用;而SP-A、SP-B对于PS有重要的调控作用。SP-A通过分子间糖和植物血凝素结合位点的相互作用而聚合磷脂，对管状髓磷脂和多板层体的形成具有重要作用;SP-A尚有拮抗血浆蛋白对PS灭活的作用及参与肺内局部免疫和炎症反应的调节作用。Greene等［9］在发生ARDS高危患者BALF中发现SP-A明显下降，SP-A异常低下者均发展成为ARDS;相反其浓度高于1.2 mg/mL者均未发展成ARDS。SP-B则直接参与肺表面张力的降低，促进磷脂在气液界面的吸附和扩张，是SP发挥作用的关键［10，11］。本研究治疗组肺泡内SP-A、SP-B含量明显高于对照组，而血清内 SP-A、SP-B含量明显减少，治疗组PaO2和PaO2/FiO2也明显高于对照组，说明SP-A、SP-B对于维持肺泡通气，提高PaO2和PaO2/FiO2有着重要作用。

肺水肿时，血浆蛋白(如白蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白单体、血红蛋白等)及细胞脂质(如胆固醇、流体膜磷脂、溶血磷脂、甘油脂等)渗出进入肺泡腔，能与PS在气液界面竞争，干扰PS单分子层的形成而抑制其表面活性，这是成人呼吸窘迫综合征发病机理中的重要因素之一，也是目前使用外源性PS替代治疗所急待解决的关键问题之一［12］。糖皮质激素能有效的减轻肺毛细血管的渗漏，一方面提高肺泡内SP的浓度;另一方面可阻止血浆蛋白向肺泡内渗漏，避免SP功能的丧失。上述两方面作用可有效保存SP的数量和功能，增加肺复张后有效的肺泡通气面积，从而改善犬的缺氧状况。本研究显示在海水浸泡致急性肺损伤的6 h内，对照组和治疗组PaO2/FiO2均低于300，经救治后均有明显改善，但治疗组改善效果明显优于对照组;对EVL-WI和ELI的检测结果显示，地塞米松可明显减轻犬肺水肿及毛细血管漏出。

总之，早期应用地塞米松治疗胸部开放伤后海水浸泡致ALI可改善缺氧和减轻肺水肿，改善缺氧的机制部分与地塞米松维持了肺泡内SP的数量和功能等因素相关。

［1］李辉，鹿尔驯，虞积耀，等.胸部开放伤后海水浸泡致多器官功能障碍综合症［J］.中华外科杂志，2000，38(8):630-632.

［2］钱桂生.急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征研究现状与展望［J］.解放军医学杂志，2003，28(2):97-101.

［3］张新红，段蕴铀，芮萌，等.不同剂量地塞米松对海水淹溺型急性肺损伤的治疗作用观察［J］.解放军医学杂志，2009，34(7): 815-818.

［4］Foex BA，Boyd R.Towards evidence based energency medicine: best BETs from the manchester royal infirmary corticosteroids in the managerment of near-drowning［J］.Emerg Mec J，2001，18(6): 465-466.

［5］丁新民，段蕴铀，彭朝胜，等.地塞米松对海水淹溺型肺水肿兔缺氧及肺水肿的改善［J］.第二军医大学学报，2005，26(12): 1361-1364.

［6］丁新民，段蕴铀，彭朝胜，等.地塞米松对海水淹溺型肺损伤兔肺组织炎症反应的抑制作用［J］.中华航海医学与高气压医学杂志，2006，13(4):199-203.

［7］李辉，鹿尔驯，虞积耀，等.胸部开放伤后海水浸泡致急性肺损伤的实验研究［J］.中国危重病急救医学，2000，12(10):598-601.

［8］李辉，王伟，尚立群，等.早期救治对犬海水浸泡胸部开放伤所致肺损伤的影响［J］.创伤外科杂志，2003，5(1):35-37

［9］Greene KE，Wright J R，Steinberg KP，et al.Serial changes insurfactant2associated protein in lung and serum before and after onset of ARDS［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999，158(3): 1843-1850

［10］Whitsett JA，Nogee LM，Weaver TE，et al.Human surfactant protein B:structure function，regulation，and genetic disease［J］.Physiol Rev，1995，75(4):749-757.

［11］Taneva S，Keough KM.Pulmonary surfactant protein SP-B and SPC in spread monolayers at the air-water interface.I.Monolayers of pulmonary surfactant protein SP-B and phospholipids［J］.Bio-phys J，1994，66(4):1137-1148.

［12］Gross NJ.Pulmonary surfactant:unanswered questions［J］.Thorax，1995，50(3):325-327.