刘 淼，张 月，何敏红，周 玲，郑 航

(南方医科大学附属南方医院，广州510515)

研究发现，高脂饮食女性发生乳腺癌的风险增加，食物中多不饱和脂肪酸如花生四烯酸(AA)摄入过多可增加乳腺癌发生的风险［1～4］。AA主要经过环氧化酶(COX)与脂氧合酶(LOX)途径进行代谢;乳腺癌患者LOX代谢产物的表达增加［5，6］。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调节细胞生长与代谢的中心信号分子，其过度激活可导致细胞增殖异常。乳腺癌患者存在mTOR信号通路的过度活化［7，8］。2012年12月～2013年6月，我们将LOX代谢产物5-羟二十烷四烯酸(HETE)、12-HETE及mTORC1抑制剂雷帕霉素(Rap)作用于体外培养的乳腺癌MCF-7细胞，探讨mTORC1在5、12-HETE促进乳腺癌发生发展过程中的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌MCF-7细胞株由本实验室保存。DMEM培养基、胰酶及胎牛血清均购自GIBCO公司，5-HETE及12-HETE购自Cayman Chemical公司，Rap购自美国惠氏公司，β-actin、S6、山羊抗兔、兔抗山羊二抗购自Santa Cruz公司，P-S6(Ser235/236)抗体购自Cell Signaling Inc公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及干预 乳腺癌MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，根据细胞生长速度适时更换培养液，用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化分散细胞，进行传代或接种于6、24、96孔板培养。取生长状态良好的细胞分为四组，对照组加入0.1%DMSO，HETE组加入5-HETE 及12-HETE 15 μmol/L，Rap 组加入 Rap 100 μmol/L，HETE+Rap 组加入 Rap 100 μmol/L 及 5-HETE+12-HETE 15 μmol/L。每一浓度设6个复孔，并设阴性对照，以空白孔调零。

1.2.2 检测指标

1.2.2.1 细胞增殖率 采用CCK-8法检测各组细胞增殖率。各组细胞培养72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，放在培养箱内继续作用4 h。采用酶标仪测定各组450 nm处测定光密度值，取6孔平均值表示MCF-7细胞增殖率。

1.2.2.2 mTORC1 通路蛋白表达 采用免疫印迹法检测mTORC1通路下游蛋白P-S6(S235/236)的表达水平。各组细胞弃去培养板内培养基，加入细胞裂解液于冰上裂解，刮离细胞移入EP管内100℃煮沸10 min。将制备的蛋白样品进行8% ～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5～2 h，Bio-Rad微型电转移系统转移至硝酸纤维素膜上(恒压100 V，约90 min)。5%脱脂奶粉/TBST于平缓摇床上室温封闭1 h，加入检测蛋白的抗体(P-S6、S6及 β-actin)，于平缓摇床上室温孵育4℃孵育过夜。TBST振荡洗膜3次，加入相应二抗，室温孵育1 h。洗膜3次加入化学发光试剂显色1 min左右，于暗盒内与X线胶片贴在一起进行曝光，X线胶片经显影、定影后扫描保存，检测P-S6、β-actin蛋白灰度值。

1.2.2.3 细胞迁移距离 各组细胞接种至6孔板，常规培养至细胞密度长至100%开始进行划痕试验。加入2 μg/mL丝裂霉素、0.5%血清培养基中孵育24 h，然后使用200 μL移液枪头自上而下划一条痕。各组细胞加药之后立即在显微镜下拍照并记录划痕的间距，分别于18、36 h后在显微镜下与前同样方法拍照并记录划痕距离。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。数据以±s表示，方差齐时多组间比较采用方差分析，然后采用LSD法进行两两比较。方差不齐时采用Welch法行多组间比较，然后采用Dunnet＇s T3法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖率 对照组、HETE组、Rap组、HETE+Rap组细胞增殖率分别为 0.85 ±0.01、1.20 ±0.13、0.53 ± 0.08、0.54 ± 0.01，HETE 组细胞增殖率高于对照组，HETE+Rap组低于HETE组(P均＜0.05)。

2.2 mTORC1通路蛋白表达 对照组、HETE组、Rap组、HETE+Rap组 P-S6蛋白灰度值分别为83.51 ±5.06、127.4 ±9.34、47.07 ±3.58、56.24 ±4.49，HETE组P-S6蛋白水平高于对照组，HETE+Rap组低于HETE组(P均＜0.01)。见图1。

图1 各组P-S6蛋白表达水平

2.3 细胞迁移距离 HETE组MCF-7细胞18、36 h后迁移距离大于对照组(P＜0.01)。HETE+Rap组细胞迁移距离小于HETE组(P＜0.05)，与对照组相仿。见表1。

3 讨论

AA是人体的一种必需脂肪酸，属于n-6系列的多不饱和脂肪酸。AA广泛参与自身免疫、过敏、哮喘、炎症等多种生理过程，与肿瘤的形成与发展也密切相关。AA可被转化为不同种类的类花生酸物质，可经 LOX途径代谢为5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE等，可通过具有生物活性的代谢产物影响细胞信号转导、细胞代谢，并与包括肿瘤在内的多种疾病发生有关，如激活P44/22有丝分裂原活化蛋白激酶和PI3K/Akt激酶途径，可促进胰腺癌细胞内DNA合成。研究发现，乳腺癌患者乳腺癌组织中AA代谢产物5-LOX与12-LOX均有高表达，提示AA能增加患乳腺癌的风险，并与乳腺癌的进展程度和预后密切相关［9～11］。本研究发现，HETE 组MCF-7细胞增殖率高于对照组，提示5、12-HETE能够促进乳腺癌细胞的增殖，在乳腺癌发生中起重要作用。

表1 各组MCF-7细胞迁移距离(μm，±s)

表1 各组MCF-7细胞迁移距离(μm，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与 HETE 组比较，#P ＜0.05

组别 迁移距离18 h 36 h HETE 组 632.96 ±24.81 748.08 ±22.82#Rap 组 512.31 ±16.88 633.25 ±30.20#HETE+Rap 组 520.74 ±32.31 630.46 ±24.85#对照组506.83 ±24.66 617.37 ±15.79

mTOR是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞内通过与其它分子形成复合物而行使生物学功能，目前认为主要形成mTORC1和mTORC2两种复合物。它整合了营养、生长因子、能量代谢和应激等多个信号通路，控制细胞生长、增殖、存活与代谢，与细胞能量代谢、脂类合成、增殖、凋亡相关［12］。mTORC1下游的直接底物为S6K1及4E-BP1，核糖体蛋白S6作为S6K1的底物磷酸化后促进核糖体的发生，从而促进蛋白质合成及细胞增殖，可作为mTORC1活性检测的重要指标。Rap是mTOR特异抑制剂，用于治疗癌症、抗移植排斥等［11］。本研究发现，5、12-HETE使 MCF-7细胞 mTORC1下游 S6的磷酸化水平升高，且这种磷酸化作用可被mTORC1抑制剂 Rap抑制;同时 Rap可抑制5、12-HETE对 MCF-7细胞的促增殖作用，提示5、12-HETE对MCF-7细胞的促增殖作用中存在mTORC1通路激活，说明mTORC1通路参与5、12-HETE促进乳腺癌发生的过程。

本研究发现，HETE组MCF-7细胞迁移距离大于对照组，HETE+Rap组细胞迁移距离小于HETE组，提示5、12-HETE可促进乳腺癌细胞的迁移，这种迁移作用可被mTORC1抑制剂Rap抑制，说明mTORC1参与了5、12-HETE促进乳腺癌迁移的过程。

综上所述，mTORC1在5、12-HETE促进乳腺癌发生发展过程中发挥关键作用，这为乳腺癌发病机理提供新内容，为发展5、12-HETE及mTORC1抑制剂、单独或联合其他药物治疗乳腺癌的新策略提供了理论依据。

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