张 南，袁晓梅，杨 洋，杨 爽，郭 敏，郭悦鹏

(1新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100;2新乡医学院第三附属医院)

免疫—炎症机制是当前支气管哮喘的主流发病学说之一［1］。近年来研究发现，辅助性 T细胞17(Th17细胞)及相关细胞因子在支气管哮喘气道炎症和气道重塑的形成过程中发挥重要作用。孟鲁司特作为一种强效选择性半胱氨酰白三烯1受体(CysLT1Rs)拮抗剂，是支气管哮喘治疗的一线用药，已被列入国内外哮喘防治指南［2］。我们于2013年5～9月观察了孟鲁司特对慢性支气管哮喘大鼠模型Th17细胞分化的影响，现分析结果并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 6～8周龄健康雄性清洁级SD大鼠，体质量140～150 g(新乡医学院实验动物中心提供)。鸡卵清蛋白(OVA，GradeⅡ，美国Sigma公司);氢氧化铝(天津市瑞金特化学品有限公司);孟鲁司特钠片(10 mg/片，鲁南贝特制药有限公司，批号10130106);大鼠白细胞介素17(IL-17)ELISA试剂盒(美国 R＆D Systems公司);抗大鼠单克隆抗体anti-CD4-FITC、anti-IL-17A-PE(美国Biolegend公司);酶标仪(MK3型，Thermo Scientific公司);流式细胞仪(FACS，美国 Beckmancoulter公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及干预 将30只大鼠按照随机数字表法分为空白对照组(对照组)、哮喘组、治疗组，每组10只。哮喘组和治疗组制作慢性支气管哮喘模型:于第1、8 d腹腔注射 OVA和氢氧化铝［Al(OH)3］干粉混合液 1 mL［含 OVA 100 mg、Al(OH)3100 mg］;于第15 d予2%OVA溶液喷雾激发，30 min/次，1次/d，连续激发8周。治疗组于每次雾化激发前1 h予孟鲁司特10 mg/kg灌胃，1次/d，共8周。对照组实验第1、8 d用等量生理盐水灌胃;于第15 d开始予生理盐水吸入刺激，30 min/次/d，连续激发8周。

1.2.2 观察项目 末次给药后24 h内测定各组以下指标。

1.2.2.1 支气管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒细胞(PMN)总数及细胞分类 麻醉大鼠，分离气管T形切口，插入塑料管并固定，用5 mL生理盐水进行肺泡灌洗，收集BALF，反复2次(回收率约80%);离心BALF，沉淀细胞用1 mL生理盐水重新悬浮，吹打均匀后计数PMN总数并行细胞分类(HE染色)，计算PMN、嗜酸性粒细胞(EOS)、单核巨噬细胞(Mf)及淋巴细胞(Ly)所占比例。

1.2.2.3 肺组织病理改变及气道形态学参数 上述指标测定后处死各组大鼠，取左肺叶固定于4%多聚甲醛中，常规脱水、石蜡包埋及切片，HE染色后观察肺组织病理特点。肺组织切片在显微镜下放大400倍，每张切片随机选取直径100～200 μm完整的小支气管横断面3个，用医学图像分析软件Imag-Pro Plus 6.0测定其基底膜周径(Pbm)、总管壁面积(WAt)、平滑肌面积(WAm)，计算总管壁厚度(WAt/Pbm)、平滑肌厚度(WAm/Pbm)。

1.2.2.4 相关性分析 对 WAm/Pbm 及 BALF中PMN总数与TH17细胞比例、IL-17水平的相关性进行分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0软件包进行统计学分析，数据均采用±s表示，行正态性检验和方差齐性检验，方差齐数据两样本均数进行t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析;方差不齐采用校正t检验，多重比较时采用SNK-q检验;两变量的相关分析采用Pearson直线相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 BALF中PMN总数及细胞分类 哮喘组BALF中PMN总数及PMN、EOS所占比例均高于对照组和治疗组(P均＜0.01);治疗组均明显少于哮喘组，但明显高于对照组(P均＜0.01)。见表1。

表1 各组BALF中PMN总数及细胞分类(n=10，±s)

表1 各组BALF中PMN总数及细胞分类(n=10，±s)

注:与对照组比较，#P ＜ ＜0.01，与哮喘组比较，△P ＜0.01

组别 细胞总数(×109/L)PMN总数(×108/L)细胞分类(%)PMN EOS Mf Ly对照组 3.53 ±0.400 2.86 ±0.40 8.09 ±0.89 1.19 ±0.30 82.87 ±1.75 7.85 ±2.10哮喘组 6.73 ±0.45# 10.81 ±0.95# 16.05 ±0.60# 7.55 ±0.79 76.01 ±1.61# 12.71 ±1.43治疗组 4.82 ±0.52#△ 5.30 ±0.74#△ 10.97 ±0.64#△ 2.16 ±0.29#△ 63.68 ±0.59#△ 10.85 ±2.51#△

2.2 Th17细胞比例及血清IL-17水平 哮喘组Th17细胞比例高于对照组及治疗组(P均＜0.01)，治疗组高于对照组而低于哮喘组(P均＜0.01)。哮喘组血清IL-17水平高于对照组和治疗组(P均＜0.01)，而治疗组高于对照组但低于哮喘组(P均＜0.01)。见表 2。

表2 各组Th17细胞比例及血清IL-17 水平(n=10，±s)

表2 各组Th17细胞比例及血清IL-17 水平(n=10，±s)

注:与对照组比较，#P ＜0.01，与哮喘组比较，△P ＜0.01

组别 Th17细胞比例(%) IL-17(pg/mL)对照组0.76 ±0.73 20.36 ±0.99哮喘组 1.95 ±0.22# 76.31 ±1.46#治疗组 1.43±0.34#△ 42.25±0.90#△

2.3 肺组织病理改变气道形态学参数 对照组细小支气管及肺泡结构正常，支气管纤毛排列整齐，支气管黏膜上皮完整，未见或少见炎症细胞浸润;哮喘组可见细支气管上皮细胞肿胀，杯状细胞增生，部分上皮细胞变性、坏死脱落;支气管管壁增厚、管腔狭窄甚至完全闭塞，支气管腔内大量黏液分泌，黏液栓形成;支气管管腔、管壁黏膜及黏膜下、肺间质可见大量炎症细胞(PMN、EOS、Ly)浸润;治疗组上述气道改变症状较哮喘组明显减轻，气管壁黏膜有轻度炎症细胞浸润。各组Pbm比较无明显差异。哮喘组WAt/Pbm及WAm/Pbm均明显高于对照组及治疗组(P均＜0.01)，治疗组高于对照组、但低于哮喘组 (P均＜0.01)。见表3。

表3 各组气道形态学参数比较(n=10，±s)

表3 各组气道形态学参数比较(n=10，±s)

注:与对照组比较，#P ＜0.01，与哮喘组比较，△P ＜0.01

组别 Pbm(μm)WAt/Pbm WAm/Pbm对照组495.40 ±32.85 24.46 ±1.51 6.55 ±0.75哮喘组 537.17 ±41.06 50.97 ±3.48# 13.53 ±2.31#治疗组 518.98 ±30.64 38.12 ±2.95#△ 8.25 ±0.97#△

2.5 相关性分析 WAm/Pbm与TH17细胞比例及IL-17水平呈显著正相关(r=0.803，P ＜0.01;r=0.893，P ＜0.01)。BALF中 PMN 与 TH17细胞比例及 IL-17水平呈显著正相关(r=0.870，P ＜0.01;r=0.975，P ＜0.01)。

3 讨论

支气管哮喘的发生涉及多种细胞因子、化学因子和相关细胞成分，是一种与免疫功能紊乱有关，以气道炎症、气道高反应性和气道重塑为重要特征的慢性疾病［3］。气道重塑是呼吸道反复炎症损伤与修复的结果，可导致不可逆性呼吸道阻塞及肺功能损害，是难治性哮喘的主要病理基础［4］。

研究证实，EOS浸润是引起哮喘的中心环节，但越来越多的研究显示，PMN引起的气道炎症也起重要作用，尤其在重度哮喘的气道炎症和重塑过程中可能起重要作用［5］。在哮喘的发病过程中，活化的PMN产生各种酶、细胞因子和炎性介质，如中性粒细胞弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMPs)、IL-8、IL-6、血小板活化因子、转化生长因子-β、白三烯(LT)等，参与黏液腺增生和黏液栓形成、气道重构和免疫调节等过程［6］。本研究哮喘组 BALF中PMN、EOS均明显高于对照组，证实PMN参与了气道炎症和气道重塑过程。

Th17细胞是新近发现的一类 T细胞亚群，IL-17是其分泌的特征性细胞因子。最新研究显示，IL-17参与了哮喘的发生、发展，可能是激素抵抗型哮喘或重症哮喘的重要发病机制之一［7］。作为一种前炎症因子，IL-17具有很强的促炎症作用，可以促进支气管纤维母细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、基质细胞等活化和成熟，使这些细胞高度表达分泌IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肿瘤坏死因子γ(TNF-γ)、单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-2)、MMPs，从而促进炎症细胞的聚集和慢性炎症的产生，造成免疫炎症损伤［8］，还可增加气道高反应程度［9］。Wilson 等［10］研究显示，IL-17 可促进PMN活化和趋化，加重气道炎症，参与气道重塑。本研究结果显示，哮喘组BALF中PMN、WAt/Pbm、Am/Pbm、Th17细胞比例、血清IL-17水平均明显高于对照组，提示Th17细胞及IL-17参与了哮喘的发生，与目前研究报道一致。

半胱氨酰白三烯(CysLT)是哮喘发生发展过程中的主要炎性反应介质，通过与各种靶细胞上Cys-LT1Rs结合，促进呼吸道内炎性反应细胞聚集和黏液分泌，增加血管通透性和气道高反应性，引起呼吸道平滑肌收缩，促进呼吸道结构细胞损伤和增殖，从而参与呼吸道炎性反应及重塑的发生过程［11，12］。孟鲁司特是一种强效选择性CysLT1Rs拮抗剂，能与人体呼吸道中CysLT1Rs高度选择性结合，阻断Cys-LT的病理作用，抑制气道炎症，降低气道高反应性，抑制气道重塑［13，14］。Wang 等［15］报道，自身免疫性脑脊髓炎动物模型中CysLT1受体信号不影响致病性辅助性T细胞的分化，孟鲁司特却可以抑制髓鞘少突胶质细胞糖蛋白特异性T细胞中IL-17的分泌。本研究结果显示，孟鲁司特可使OVA致敏哮喘大鼠气道炎症及平滑肌厚度增厚程度减轻，对气道重塑有明显的抑制作用;同时可抑制Th17的分化及IL-17释放，使BALF中PMN减少，减轻炎症细胞在支气管内的积聚。

综上所述，孟鲁司特可减轻哮喘大鼠的气道炎症及抑制其气道重塑;其机制可能为抑制Th17细胞活化，减少IL-17的合成和释放。

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