刘鹏飞，崔春萍，门同义

(1山东省医学科学院，济南250021;2济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院;3军事医学科学院放射与辐射医学研究所;4山东省千佛山医院)

近20年来肾细胞癌的发病率和病死率不断升高［1，2］，已经成为男性中第 7、女性中第 8 位的常见癌症。研究证实，缺氧诱导因子(HIF)在肾癌的发生中起重要作用，其作为转录因子参与血管生成、肿瘤细胞的增殖、细胞的迁移等过程［3］。HIF由一个α 亚基(HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α)和一个 β 亚基组成。β亚基作为结构单位稳定存在，而α亚基作为功能单位很不稳定，只有在低氧环境中存在;最近的研究表明HIF-2α在肾细胞癌的致癌中起重要作用。为研究HIF-2α表达对下游靶基因、细胞生物学特征和致癌能力的影响，我们构建了带绿色荧光蛋白(GFP)并稳定干涉 HIF-2α的 PLKO.1-shHIF-2α的慢病毒载体，并对所得产物进行了鉴定。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 2×Taq PCR MasterMix试剂购于北京庄盟生物公司，凝胶回收试剂盒购于 Promega公司;DH5α大肠杆菌感受态细胞购自北京天根生物科技公司;大剂量质粒提取试剂盒购自Vigorous公司;小剂量质粒提取试剂购自威格拉斯公司。限制性内切酶 BamHl HF 、Spel HF、Agel、EcoRl和 T4 DNA 快速连接试剂盒购自NEB公司。人786-0细胞购于中国科学院上海细胞库，质粒 PCDH、PLKO.1-puro、pMD2G，pSAX2及293FT细胞均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所保存。引物设计:HIF-2α干涉片段上下游引物分别为:5'-CAACCTGCAGCCTCAGTGTATC-3'和5'-CACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。根据NCBI提供的PLKO.1-puro病毒包装构建手册合成包装慢病毒的片段(北京奥克生物技术公司合成)，序列如下:5'-CCGGCAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGATTTTTTG-3'和5'-AATTCAAAAACAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。以质粒PCDH为模板，设计EF1-EGFP片段上下游引物分别为:5'-GGACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGT-3'(含 Spel酶切位点)和 5'-CGGGATCCGCGAGATCCGGTGGAGCCGGGT-3'(含BamHl酶切位点)，由北京奥克公司进行合成。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因HIF-2α干涉片段和EF1-EGFP片段获取 体外合成的单链HIF-2α干涉片段经过退火后形成双链片段(95℃ 4 min，70℃ 10 min)。以PCDH质粒为模板，扩增EF1-EGFP片段，用2×Taq PCR MasterMix实行 PCR(94℃、30 s，60℃、2 min，35个循环;72℃延长10 min)，PCR产物1%琼脂糖电泳后胶切割并胶回收，得到EF1-EGFP片段，预计约为 1.3 kb。

1.2.2 带GFP的慢病毒载体质粒PLKO.1-shHIF-2α的构建 分别用AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切目的片段干涉HIF-2α序列和PLKO.1-puro质粒(37℃水浴3 h，70℃灭活20 min)，采用T4 DNA连接酶连接上述双酶切的胶回收产物(16℃水浴18 h)。转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取阳性菌落，扩增后提取质粒。AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定(37℃水浴2 h)，预计得到1.9 kb的片段。鉴定连接成功后，将质粒与EF1-EGFP片段分别用BamHl HF和Spel HF双酶切。再次用T4 DNA连接酶连接上述双酶切的胶回收产物。转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取阳性菌落，扩增后提取质粒。BamHl HF和Spel HF双酶切鉴定，预计得到1.3 kb的片段。

1.2.3 慢病毒载体 PLKO.1-shHIF-2α 的包装及浓缩 具体方法参照文献［4］。采用磷酸钙沉淀法将载体质粒 PLKO.1-shHIF-2α 与 pMD2G，pSAX2共转染293FT细胞。转染12 h后更换完全培养基，72 h后收集上清液，无菌滤器过滤后得病毒原液。将病毒原液在超速冷冻离心机中3 000 r/min、4℃ 离心30 min，弃上清液，再以合适体积的IMDM重悬沉淀，使病毒颗粒充分悬浮，得到病毒浓缩液。整个过程在冰水混合物中进行，分装后 －80℃冻存。

1.2.4 慢病毒载体 PLKO.1-shHIF-2α 的鉴定 在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中用RPMI1640培养液培养786-0细胞，细胞达80%汇合后传代。收集适量的处于对数生长期的786-0细胞，加入96孔板中，每孔再加入不同稀释倍数的病毒浓缩液，48 h后荧光显微镜下观察GFP的表达情况。

2 结果

2.1 EF1-EGFP片段扩增结果 以PCDH为模板，PCR扩增出了带BamHl和Spel接头的EF1-EGFP片段，电泳显示条带大小与预期一致。见图1。

图1 EF1-EGFP片段PCR扩增结果

2.2 PLKO.1-shHIF-2α 干涉HIF-2α 片段鉴定 连接体系转化感受态大肠杆菌DH5a约长出10个菌落，提取菌落质粒，用Agel和EcoRl双酶切后电泳可见1.9 kb片段，表明PLKO.1-shHIF-2α 干涉HIF-2α片段连接成功。见图2。

图2 PLKO.1-shHIF-2α干涉HIF-2α片段

2.3 PLKO.1-shHIF-2α EF1-EGFP片段的鉴定 连接体系转化感受态大肠杆菌DH5a约长出5个菌落，提取菌落质粒，用BamHl HF和Spel HF双酶切后电泳可见1.3 kb片段，表明 PLKO.1-shHIF-2α 的EF1-EGFP片段连接成功。见图3。

图3 PLKO.1-shHIF-2α EF1-EGFP片段

2.4 测序结果 各连接点正确，序列与已知序列相符，表明干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段已正确插入PLKO.1-puro质粒中，证实 PLKO.1-shHIF-2α质粒构建成功。

2.5 细胞感染效率 不同稀释度的病毒浓缩液感染786-0细胞48 h后，在倒置荧光显微镜下可见96孔板内出现绿色荧光。以103稀释度和106稀释度为例，后者较前者荧光强度明显降低，见图4。

3 讨论

近来研究发现HIF-2α在肾细胞癌中存在异常表达，与肾细胞癌发生发展存在密切的关系。Mandriota等［5］研究发现在肾透明细胞癌中检测到更高的 HIF-2α表达，且表达增加与进展期肿瘤损害程度有关。Sowter等［6］研究证实，HIF-2α 的表达主要出现在肾透明细胞癌细胞中;研究还发现，HIF-2α与VHL、VEGF、TGF-α及cyclin-D1表达均有密切关系［7］。因此，为进一步研究HIF-2α表达对RCCs的生物学作用，以及其对下游靶基因的调控，建立稳定干扰HIF-2α的细胞株是必要的。

图4 慢病毒载体感染786-0细胞48h的鉴定后GFP的表达

本研究中我们使用RNA干扰(RNAi)方法成功构建了带GFP的HIF-2α干涉载体。RNAi是近年来发现的一种调节mRNA的生物学现象，能够使基因表达的mRNA被相应的双链RNA分子敲除，其效果要远强于正义和反义RNA［8］，在治疗肿瘤及病毒感染方面也展现了相当好的前景［9］。慢病毒载体作为最近实验室经常采用的一种新型病毒载体，其优点是具有获得病毒滴度高，周期短，可以感染非分裂细胞、分裂细胞，而且能够整合到宿主基因组中，从而稳定的表达目的基因等特点。慢病毒干涉载体的技术是将慢病毒载体的特点和RNAi技术的优点结合到了一起，从而使得其能够整合到宿主基因组从而发挥稳定的RNA干涉效果，使得在基因功能领域研究中RNA干涉技术的应用和作用得以更广泛的发挥。本研究应用的PLKO.1-puro是一种复制缺陷型慢病毒载体，可以直接通过转染操作被导入细胞，已经被作为常规RNAi载体使用，也可以被包装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。其一旦进入细胞内，就可以整合到基因组中，稳定表达shRNA和具有Puromycin抗性，Puromycin抗性基因的筛选可以杀灭掉没有整合慢病毒载体的细胞且不稳定表达的细胞，从而得到基因组中有整合慢病毒载体的稳定的细胞系。同时GFP性质稳定，通常不影响目的基因表达产物的生物学活性，能根据GFP融合蛋白的绿荧光的分布来分析目的蛋白在细胞中的分布和定位，并且可以利用荧光显微镜直观地判断转染效率，有利于筛选目的基因和GFP共表达的阳性细胞，从而得到持续表达该目的基因的细胞株［10］。我们在荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光，提示该融合质粒能在肾癌786-0细胞中成功表达，从而为进一步探究HIF-2α对肾癌细胞生物学行为的影响奠定了基础。

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