林宝山，兰道亮，黄 偲，陈亚冰，黄 勇，李 键．＊

（1．西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2．西南民族大学青藏高原研究院，四川成都610041）

牦牛TLR2基因的克隆及序列分析＊

林宝山1，兰道亮2，黄 偲1，陈亚冰1，黄 勇1，李 键1．2＊

（1．西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2．西南民族大学青藏高原研究院，四川成都610041）

为了解牦牛天然免疫受体TLR2基因特点，根据GenBank中已公布的牛TLR2基因序列分段设计引物，克隆并对所得结果进行序列分析。基因序列分析表明，克隆得到牦牛TLR2基因编码区全长2 620 bp，开放阅读框2 355 bp，编码氨基酸784个，分子质量90．024 6 ku，理论等电点为6．46。蛋白预测结果表明，TLR2编码蛋白整体表现为亲水性。同源性分析表明，11条序列中牦牛与野牦牛、普通牛、绵羊等物种具有较高的同源性，在系统发育树中距离最近。结果说明TLR2基因序列具有较高的保守性。牦牛TLR2基因序列的成功克隆对牦牛及高原动物抗病及免疫应答分子机制等研究提供理论基础。

Toll样受体2；基因克隆；序列分析；牦牛

Toll样受体（TLRs）作为一类重要的天然免疫模式识别受体，可通过病原相关模式分子（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）识别病原微生物，在天然免疫系统、感染和炎症期间检测病原微生物配体等发挥着“哨兵”的重要作用［1］。截至目前，在哺乳动物和人上已发现的TLRs有11种（TLR1～TLR11），其中TLR2因其表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多而成为Toll样受体家族中研究较多的一类重要受体，其在巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和T淋巴细胞等多种免疫细胞表面均有表达［2］。近年来随着研究的不断深入，其在免疫应答中的功能与发挥的作用越来越受学者的关注。大量研究证明，TLR2受体能够识别大多数病原微生物及其产物，能够识别革兰阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸、革兰阴性菌的类脂A、分支杆菌和脂蛋白与脂肽和细菌 DNA 等［3－4］。此外，TLR2能直接识别病毒蛋白，如人巨细胞病毒蛋白与麻疹病毒的血凝素。除了识别病毒颗粒外，还识别真菌的甘露聚糖。研究发现，TLR2还参与轮状病毒引发的宿主免疫应答反应的启动和调节。TLR2除了在细菌、病毒、真菌等感染中发挥作用外，对其他一些病原体或组分也可以识别和结合，如支原体脂蛋白、螺旋体的脂蛋白与脂肽及一些寄生虫等［5－6］。因此，深入了解TLR2不仅有重要的理论意义，并且具有非常重要的现实意义。

牦牛作为高原古老物种能够在青藏高原高寒、低氧等恶劣气候环境下生存，其抗病的免疫机制与普通牛等低海拔动物相比存在特殊性，研究其免疫机制对研究其他高原模式动物免疫机制有借鉴意义。此外，牦牛疾病尤其是重大疫病发病有逐年上升的趋势，严重阻碍了牦牛产业的健康发展。研究其抗病分子机制对牦牛疫病的防控具有重要意义。TLRs作为天然免疫受体，在机体发生感染过程中发挥着非常重要的作用。TLRs在牛、绵羊、人、兔、小鼠及禽类等多个物种都已有相关研究报道［7－8］。但其在牦牛病原感染等相关方面的研究尚未见报道。本研究首次克隆牦牛TLR2基因，并对所得序列进行生物信息学分析及预测，为今后研究高原牦牛抗病分子机制及高原动物的模式免疫机制具有重要意义。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试剂 大肠埃希菌DH 5α为天根生化科技（北京）有限公司产品；p MD 19－T克隆载体为宝物工程（大连）有限公司产品；凝胶回收试剂盒为Axygen（北京）公司产品；Trizol为Invitrogen公司产品；反转录酶为Fermentas公司产品。

1．1．2 试验用动物 试验所用材料为牦牛脾组织，采自成都市青白江区唐家寺向阳牛市屠宰场，属于麦哇品种牦牛（四川阿坝）。

1．2 方法

1．2．1 引物设计与合成 根据GenBank中牛TLR2（登录号：NM－174 197．2）基因序列，用Premier 5．0软件分3段设计引物，引物序列与预期扩增片段长度如表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 TLR2基因的引物序列Table 1 Primer sequences of TLR2 gene

1．2．2 组织RNA的提取和cDNA的反转录合成 根据总RNA裂解液Trizol说明书，按每100 mg牦牛脾脏组织加入1 m L Trizol液研磨提取总RNA；按照Fermentas公司的Revert AidTMFirst Strand c DNA Synthesis Kit反转录酶说明书，采用20μL体系：Oligo（d T）18 1μL，5×Reaction buffer 4μL，RibolockTMRwase Inhibitor（20μ／μL）1μL，10 mol／L d NTP Mix 2μL，Revert AidTMM－Mu LV Reverse Transcriptase（200μ／μL）1μL，模板1μL，最后用RNase Free d H2O补足20μL，按以下程序进行反转录反应：42℃60 min；70℃5 min，合成第1链cDNA，置－20℃保存。

1．2．3 目的基因的克隆 以牦牛脾脏组织cDNA为模版，引物为S1、A1、S2、A2、S3、A3进行普通PCR扩增，扩增体系为50μL。所有PCR产物经10 g／L琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，用Axygen的凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，取适量已纯化PCR产物与克隆载体p MD19－T进行连接，转化DH 5α感受态细胞并在含Amp＋琼脂平板上涂菌。挑取单个菌落接种于含Amp的LB液体培养基中。经PCR鉴定后，将阳性重组质粒送往Invitrogen（上海）公司测序。

1．2．4 目的基因序列分析 将测序结果拼接，并用DNA Star软件、Bio XM软件、Cltulax软件以及http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa－automat．plpage＝npsa－gor4．html等在线软件对序列进行分析。

2 结果

2．1 目的基因的扩增

牦牛TLR2基因分3段扩增，分段扩增结果如图1。3个扩增片段大小分别在903、1 071、1 132 bp左右，与预期扩增片段大小基本相符。

图1 牦牛TLR2基因PCR扩增结果Fig．1 PCR products of TLR2 gene in yak

2．2 基本理化性质分析

扩增得到牦牛TLR2基因编码区全长3 620 bp（GenBank登录号：KF977429），并通过http：／／web．expasy．org／protparam／等生物信息学在线软件对其基本理化性质进行了分析。结果显示，TLR2基因开放阅读框全长2 355 bp，编码氨基酸784个，分子质量90．024 6 ku，理论等电点为6．46。氨基酸组成中，正电荷残基为84个，负电荷残基为90个，整个蛋白带负电荷。蛋白不稳定系数为41．90，提示该蛋白可能为不稳定蛋白。

2．3 TLR2基因编码产物亲、疏水性，柔韧性及抗原性预测

用DNA Star软件子程序Prostean对TLR2基因编码产物的亲、疏水性，柔韧性及抗原性进行预测，由图2可知，TLR2基因亲水性残基所占比例大于疏水性残基，因此推测其编码蛋白整体表现为亲水性。柔韧性区域分布相对均匀。抗原表位区域较大，与柔韧性区域和表面可能性区域出现了较多的重叠区，这些区域相对易于变形，便于抗原、抗体的自由结合，可能是抗原位点的富集区。

2．4 TLR2蛋白质二级结构预测

运用在线软件 （http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa－automat．plpage＝ npsa－gor4．html）对TLR2编码的蛋白质二级结构进行预测，如图3所示，该蛋白α－螺旋（Alpha helix）占34．44%；自由卷曲（random coil）占 47．32%；延 伸 链 （extended strand）占18．24%。

图2 牦牛TLR2基因亲水性、柔韧性及抗原性的预测结果Fig．2 Predict results of hydrophilicity，flexibility，surface probability and antigenicity of TLR2 in yak

图3 TLR2蛋白二级结构的预测Fig．3 The predicton of secondary structure of TLR2 protein

2．5 同源性分析

利用DNA Star软件子程序Meg Align的Clustal W方法与GenBank中公布的部分物种TLR2基因序列进行同源性比较结果如图4所示。结果显示，牦牛TLR2基因与其他11条序列相比，同源性最高的是野牦牛和牛的TLR2基因序列，分别为99．8%和99．0%；最低的是斑点叉尾鮰和红鳍东方鲀，为28．6%和25．8%；与家犬、人、猕猴、绵羊、野猪、马的同源性都高于85%；与小家鼠的同源性为73．7%。该结果说明TLR2基因在哺乳动物间具有较高的保守性。

2．6 遗传进化树

用 MEGA 5．0 软件 Neighbor－Joining法重复1 000次，将获得的12条TLR2基因序列构建Boot－strap验证的系统遗传进化树，如图5所示。牦牛与野牦牛和牛TLR2基因的亲缘关系最近，并与绵羊、野猪、马、家犬、猕猴、人、小家鼠形成哺乳动物的一个分支，然后斑点叉尾鮰和红鳍东方鲀形成一个与牦牛遗传距离较远的分支。

3 讨论

图4 TLR2基因的核苷酸序列同源性比较Fig．4 Homologus alignment of TLR2 gene sequences

图5 TLR2基因的核苷酸序列系统进化树Fig．5 Phylogenetic tree of TLR2 gene sequences

TLRs是近年来发现的一类天然免疫受体，在机体天然免疫防御及病原感染过程中发挥着重要作用［9］，它们可以直接识别结合某些病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，即病原相关分子 模 式 （pathogen－associated molecular patterns，PAMPs），引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的 释放，并最终激活获得性免疫系统［10－11］。TLR2作为TLRs家族的重要成员，其在病原微生物识别以及在机体免疫应答中发挥的功能与作用越来越受到重视［12］。牦牛因其能够在青藏高原高寒、低氧等恶劣气候环境下生存，被认为是研究高原动物环境适应性、高原动物免疫机制等方面模式动物。近年来，TLRs在牛、绵羊、人、兔、小鼠及禽类等多个物种都已有相关研究报道［13－15］，而 TLRs在牦牛上的研究尚未见报道。本研究首次成功克隆了牦牛TLR2基因，并对所得序列进行生物信息学分析及预测，为今后深入研究牦牛免疫分子机制提供了基础。

本研究利用生物信息学相关软件对所得序列进行了分析，结果显示牦牛TLR2基因的m RNA序列与野牦牛相比仅存在17个碱基的差异，同源性为99．8%，但并未导致氨基酸序列的改变。同时，与牛的同源性达到了99%；与其他哺乳动物的同源性也达到80%以上，这说明在近缘物种，尤其在哺乳动物中TLR2具有较高的保守性。由此推测该基因具有非常重要的生理功能，其表达的蛋白质对于不同物种都有着重要意义。此外，牦牛与牛、绵羊等内地平原物种相比生活生长环境恶劣，同等条件下对高寒低氧所致疾病的抵抗能力相对较强，但其在TLR2基因上却表现出相当高同源性，这提示我们这种差异有可能存在于编码区之外的区域，如启动子区域或是由于甲基化等表观遗传学上的差异造成。

本研究首次克隆了牦牛TLR2基因，并进行了相关序列分析，旨在为进一步深入研究TLR2基因在牦牛抗病机制等方面所发挥的功能和作用提供基础。试验后续将对不同氧分压下生活的同种牦牛各主要器官TLR2表达量进行定量分析，并与不同海拔近缘动物进行对比，以确定TLR2基因的表达是否存在明显差异性，从而进一步揭示TLR2基因在牦牛疾病免疫应答机制中所发挥的作用。

［1］ Katherine L I，Lee J H，Monique G，et al．The molecular basis for recognition of bacterial ligands at equine TLR2，TLR1 and TLR6［J］．Vet Res，2013，44（1）：50．

［2］ 于莉莉，韩代书．Toll样受体（TLR）介导的天然免疫间的相互调节［J］．中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（1）：79－84．

［3］ Mrinal S，Banikalyan S，Madhubanti B，et al．Molecular charac－terization of toll－like receptor 2（TLR2），analysis of its inductive expression and associated down－stream signaling molecules following ligands exposure and bacterial infection in the Indian major carp，rohu （Labeorohita）［J］．Fish ＆ Shellfish Immunology，2012，32（3）：411－425．

［4］ 杨芳芳，陈成水．Toll样受体2的研究进展［J］．医学综述，2008，14（11）：1636－1639．

［5］ Juliana G D O，Ana E S．Polymorphisms of the TLR2 and TLR4 genes are associated with risk of gastric cancer in a Brazilian population［J］．World J Gastroenterol，2012，18（11）：1235－1242．

［6］ 顾兆伟，曹志伟，王韫秀，等．TLR2和 TLR4在慢性鼻窦炎鼻息肉中的表达及临床意义［J］．中国耳鼻喉颅底外科杂志，2013，19（1）：43－47．

［7］ Jung S C，George C R，Oliver J，et al．Molecular cloning and characterization of Toll－like receptors 1－10 in sheep［J］．Vet Immunol Immunopathol，2009，12（7）：94－105．

［8］ Lan C，Mei J L，Ling L Z，et al．Analysis of TLR4 and TLR2 polymorphisms in inflammatory bowel disease in a Guangxi Zhuang population［J］．World J Gastroenterol，2012，18（46）：6856－6860．

［9］ 周 峰，薛 云，龙 塔，等．南阳黄牛TLR2基因扩增及序列分析［J］．动物医学进展，2012，33（8）：17－22．

［10］ 张晓茹，匡文华，成 鹰，等．水牛TLR2 cDNA的克隆与生物信息学分析［J］．动物医学进展，2011，32（11）：35－41．

［11］ Shi Z A，Kiyoshi T，Tsuneyasu K，et al．Toll－like receports：critical proteins linkong innate and acqured immunity［J］．Nature Publishing Group，2001，2（8）：675－680．

［12］ 张建军，吴河水，王 琳，等．TLR2和TLR4在胰腺癌中的表达及其意义［J］．中国普通外科杂志，2010，19（3）：239－244．

［13］ Shyam D，Govindasamy N，Vijay K，et al．Sequence analysis of the Toll－like receptor 2 gene of old world camels［J］．J Adv Res，2013，9（1）：1－11．

［14］ 李根亮，穆淑梅，李彦芹，等．TLR－天然免疫中的特异性受体［J］．生命化学，2006，26（6）：495－497．

［15］ Katrin M J，Ashleigh R，Kay P，et al．Leptin up－regulates TLR2 in human monocytes［J］．J Leukocyte Biol，2013，93（4）：561－571．

Cloning and Sequence Analysis of TLR2 Gene from Yak

LIN Bao－shan1，LAN Dao－liang2，HUANG Cai1，CHEN Ya－bing1，HUANG Yong1，LI Jian1，2

（1．CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China；2．CollegeofTibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

To understand the characteristics of the yak innate immune receptors TLR2 gene，the primers were designed according to the published cattle TLR2 gene sequence in the Gen Bank．TLR2 gene was divided into three sections for amplification，sequencing，splicin and for bioinformatics analysis and prediction．The results of sequence analysis showed that the length of the cloning TLR2 cDNA is 2 620 bp，containing a complete 2 355 bp open reading frame（ORF）．It encodes a peptide of 784 amino acids whose calculated molecular weight is 90．024 6 ku；PI is 6．46．The results of protein prediction showed that TLR2 protein performs as the hydrophilicity．Sequence homology analysis showed that yak has higher homology with wild yak，cattle，sheep and other species among the 11 sequences，which has the nearest perimeter in the phylogenetic tree．The results showed that TLR2 gene sequence is very conserved in mammals．The successful cloning of TLR2 gene sequence of yak provides further insight into the study on the disease resistance and molecular mechanism of immune response of yak and other plateau animals in Qinghai Tibet Plateau．

TLR2；gene cloning；sequence analysis；yak

S858．23；Q785

A

1007－5038（2014）07－0059－05

2013－12－24

西南民族大学2014年研究生“创新型科研项目”（CX2014SZ98）

林宝山（1987－），男，甘肃天祝人，硕士研究生，主要从事高原动物免疫分子机制研究。＊通讯作者