刘恩岐，李 华*，巫永华，张建萍，陈振家

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100； 2.徐州工程学院，江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221008；3.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801)

黑豆与黄大豆的主要营养成分十分相似，且黑豆蛋白质含量较高，氨基酸组成总体优于黄豆，有研究报道[1-2]黑豆苏氨酸含量比黄豆高15.3%，蛋氨酸高29.0%，是一种优质蛋白资源。国内外研究发现，通过对蛋白质适当酶解可以得到具有各种功能的生物活性肽[3]，通过酶法水解黑豆蛋白制备生物活性肽，价廉易得，安全性高，具有良好的开发前景[4]。疲劳是体力活动时出现原有工作能力暂时下降的一种正常生理现象，又可能是机体发展到伤病状态的一种先兆[5]。自由基理论认为，抗氧化与缓解体力疲劳具有一定的关系，人体运动时血红蛋白的氧化速度增加，产生的自由基大量消耗机体内的抗氧化物质，打破了正常生理条件下自由基生成和清除之间的动态平衡，导致细胞损伤、功能降低而使机体产生疲劳[6-8]。陈园园[9]、王勇刚[10]等研究显示，大豆肽的抗氧化能力与抗疲劳效果具有显著的正相关性。本实验采用Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶对黑豆蛋白进行组合水解，通过超滤和大孔树脂吸附分离获得抗氧化活性较强的黑豆肽，按照我国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》进行缓解体力疲劳动物研究，并对抗氧化与缓解体力疲劳黑豆肽组分进行相对分子质量分布和氨基酸组成分析，为功能性黑豆肽的开发提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

晚熟小粒黑豆由山西农业大学大豆育种研究室提供；健康雄性昆明种小鼠，体质量(20±2)g，均为SPF级，由徐州医学院实验动物中心提供。

Alcalase、Neutrase、Flavourzyme蛋白酶 丹麦诺维信(中国)生物技术有限公司；DA201-C大孔吸附树脂 江苏苏青水处理工程集团有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司；乳酸试剂盒、尿素氮试剂盒、肝糖元试剂盒 南京建成生物工程研究所；还原型谷胱甘肽 美国Amresco公司；甲醇、乙醇 国药集团化学试剂有限公司； 相对分子质量标准品 Fluka进口分装。

1.1.2 仪器与设备

Synergy H1全功能酶标仪 美国Bio Tek公司；Alpha1-2 LO plus真空冷冻干燥机 德国Christe公司；Labscale TFF小型切向流超滤系统 美国Millipore公司；5417R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；HYG-Ⅱ恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司；AKTA蛋白纯化系统、Sephadex G-25凝胶过滤色谱柱 美国安玛西亚公司；玻璃游泳箱(50cm×50cm×40cm)。

1.2 黑豆肽的制备与抗氧化活性测定

1.2.1 酶法水解制备黑豆肽粗粉

采用碱提酸沉法提取黑豆蛋白，将质量浓度为5g/100mL的黑豆蛋白水溶液于90℃加热10min使蛋白质变性，冷却至60℃用2mol/L的氢氧化钠溶液调至pH8.5，加入Alcalase酶水解30min，pH值降到7.0左右，加入Neutrase酶50℃水解60min，pH值降到6.0左右，再加入Flavourzyme酶水解30min，在pH值渐变条件下，对黑豆蛋白进行分步组合水解，以提高酶解液的水解度和多肽含量[11-12]。加热灭酶冷却后，于4000r/min离心10min取上清液，经冷冻干燥得到黑豆肽粗粉。

1.2.2 黑豆肽粗粉的超滤与大孔树脂吸附分离

分别用截留相对分子质量为3000、5000和10000的超滤膜对黑豆肽进行分离[13]，冻干后测定其DPPH自由基清除率。采用DA201-C树脂对抗氧化活性较强的黑豆肽超滤组分进行充分吸附[14]，依次用体积分数为25%、50%、75%和100%乙醇洗脱3h，得到按疏水性大小分离的黑豆肽组分[15]，冻干后测定其DPPH自由基清除率。以抗氧化活性相对最强的大孔树脂吸附分离黑豆肽组分进行缓解体力疲劳的动物实验。

1.2.3 DPPH自由基清除率的测定[16]

在96孔酶标板中，加入质量浓度为1mg/mL的黑豆肽样品和0.2mg/mL的DPPH甲醇溶液各100μL，应用Bio Tek酶标仪振荡30s，常温条件下避光放置20min，于517nm波长处测定其吸光度(A1)；同时测定加黑豆肽样品但不加DPPH(以同体积甲醇代替DPPH)的空白吸光度(A0)，加DPPH但不加样品(以同体积甲醇代替样品)的吸光度(A2)，按公式(1)计算DPPH自由基清除率。

1.3 黑豆肽缓解体力疲劳功能动物实验

1.3.1 实验动物分组与给药

由徐州医学院动物实验中心进行动物实验。将小鼠随机分为空白对照组、谷胱甘肽阳性对照组(GSH阳性对照组)和黑豆肽低、中、高剂量组5组，每组25只小鼠[17]。样品组低、中、高剂量组分别灌胃250、500、1000mg/(kg·d)黑豆肽，空白对照组灌胃1000mg/(kg·d)生理盐水，谷胱甘肽阳性对照组灌胃50mg/(kg·d)，连续灌胃30d[18]。

1.3.2 负重游泳

小鼠末次灌胃30min后，将其尾根部负荷5%体质量的铅丝，置于玻璃游泳箱中游泳，水深40cm，水温(25.0±1.0)℃，记录小鼠从游泳开始至头部没入水面以下7s不再上浮的时间。

1.3.3 血乳酸含量测定

小鼠末次灌胃30min后，置于水温(30.0±1.0)℃游泳箱中不负重游泳10min后取出，立即拔眼球采血100μL，用乳酸试剂盒测定血乳酸含量。

1.3.4 血清尿素氮含量测定

小鼠末次灌胃30min后，置于水温(30.0±1.0)℃游泳箱中不负重游泳90min，休息60min后拔眼球采全血0.5mL，置于4℃冰箱约3h，血凝固后2000r/min离心15min取血清，采用尿素氮试剂盒测定血清尿素氮含量。

1.3.5 肝糖原含量测定

小鼠末次灌胃30min后，置于水温(30.0±1.0)℃游泳箱中不负重游泳90min，休息60min后，立即处死，取肝脏，采用肝糖原测试盒测定小鼠肝糖原含量。

1.4 黑豆肽的相对分子质量分布与氨基酸组成测定

1.4.1 相对分子质量测定

采用Sephadex G-25凝胶色谱柱对黑豆肽进行相对分子质量分布测定。黑豆肽样品质量浓度为500mg/mL，12000r/min离心5min，取上清液进样，上样量为0.5mL。以Tris-HCl缓冲液(pH7.0，20mmol/L)为洗脱液，洗脱流速1.5mL/min，通过紫外检测仪在280nm波长处检测，自动收集各洗脱峰，冷冻干燥各洗脱组分并测定其DPPH自由基清除率。

相对分子质量校正曲线所用标准品为：牛血清蛋白(Mr6640)、抗菌肽(Mr1422)、氧化型谷胱甘肽(Mr612)、还原型谷胱甘肽(Mr307)、L-半胱氨酸(Mr121)；根据标准品洗脱体积V(mL)与其相对分子质量对数值(lgMr)建立的标准曲线回归方程如式(2)所示。

1.4.2 氨基酸组成测定

采用氨基酸自动分析仪测定黑豆肽中除色氨酸外的氨基酸含量。

2 结果与分析

2.1 黑豆肽的抗氧化活性

2.1.1 黑豆肽超滤分离组分的抗氧化活性比较

表 1 黑豆肽超滤分离组分的DPPH自由基清除率比较(±s)Table 1 DPPH free radical scavenging activity of fractions from ultrafiltration (±s)

表 1 黑豆肽超滤分离组分的DPPH自由基清除率比较(±s)Table 1 DPPH free radical scavenging activity of fractions from ultrafiltration (±s)

相对分子质量(Mr)＞100005000～10000 3000～5000＜3000 DPPH自由基清除率/%25.06±0.5231.07±0.6737.41±0.7851.06±0.92

由表1可知，相对分子质量＜3000的黑豆肽超滤组分具有相对最强的DPPH自由基清除率，因而基于该组分对黑豆肽进行大孔树脂吸附分离。

2.1.2 黑豆肽大孔树脂吸附分离组分的抗氧化活性比较

表 2 黑豆肽大孔树脂吸附分离组分的DPPH自由基清除率比较(±s)Table 2 DPPH free radical scavenging activity of fractions from DA201-C MAR purification (±s)

表 2 黑豆肽大孔树脂吸附分离组分的DPPH自由基清除率比较(±s)Table 2 DPPH free radical scavenging activity of fractions from DA201-C MAR purification (±s)

洗脱乙醇体积分数/%255075100 DPPH自由基清除率/%33.06±0.5250.07±0.6771.41±0.9161.06±0.72

由表2可知，DA201-C大孔树脂吸附的75%乙醇洗脱分离的黑豆肽组分具有相对最强的DPPH自由基清除率，因此确定以该组分进行缓解体力疲劳功能的动物实验。

2.2 黑豆肽缓解体力疲劳功能动物

2.2.1 黑豆肽对小鼠负重游泳时间的影响

表 3 黑豆肽对小鼠负重游泳时间的影响(±s，n=8)Table 3 Effect of BSPs on loaded-swimming time in mice (±s，n=8)

表 3 黑豆肽对小鼠负重游泳时间的影响(±s，n=8)Table 3 Effect of BSPs on loaded-swimming time in mice (±s，n=8)

注：*.与空白对照组相比，差异显著(P ＜0.05)；**.与空白对照组相比，差异极显著(P ＜0.01)。表4 同。

组别空白对照组 GSH阳性对照组 低剂量组中剂量组高剂量组负重游泳时间/min 104.83±11.07 160.16±28.73** 148.50±20.12* 167.50±25.95** 194.83±25.98**

运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，负重游泳时间的长短可以反映动物运动疲劳的程度[20]。由表3可知，黑豆肽组小鼠负重游泳时间与空白对照组相比均明显延长，低剂量组具有显著差异(P＜0.05)，中、高剂量组具有极显著差异(P＜0.01)，由此可判定低、中、高剂量组实验结果均为阳性，能显著提高小鼠的运动耐力。谷胱甘肽(GSH)是动植物体内广泛存在的抗氧化物质[21]，中剂量组与GSH阳性对照组小鼠负重游泳时间十分接近，表明灌胃500mg/(kg·d)黑豆肽与灌胃50mg/(kg·d)谷胱甘肽的负重游泳效果基本相当。

2.2.2 黑豆肽对小鼠血乳酸、血清尿素氮与肝糖原含量的影响

表 4 黑豆肽对小鼠血乳酸、血清尿素氮与肝糖原含量的影响(±s，n=8)Table 4 Effect of BSPs on mice of the contents of BLA, SUN and HG (±s，n=8)

表 4 黑豆肽对小鼠血乳酸、血清尿素氮与肝糖原含量的影响(±s，n=8)Table 4 Effect of BSPs on mice of the contents of BLA, SUN and HG (±s，n=8)

组别血乳酸含量/(mmol/L) 血清尿素氮含量/(mol/L) 肝糖原含量/(mg/g)空白对照组37.96±3.787.87±0.8512.41±0.13 GSH阳性对照组35.49±1.087.65±0.6914.47±0.28**低剂量组34.79±1.117.70±0.9914.62±0.36**中剂量组23.20±0.30**7.23±0.6617.87±1.02**高剂量组18.44±1.91**6.78±0.8921.96±0.42**

由表4可知，黑豆肽中、高剂量组的血乳酸(BLA)含量与空白对照组有极显著差异(P＜0.01)，但低剂量组差异不显著，由此可判定中、高剂量组结果均为阳性，能显著减少运动时乳酸的积累，从而缓解体力疲劳程度。黑豆肽低、中、高剂量组的血清尿素氮(SUN)含量与空白对照组均差异不显著，据此推测黑豆肽不能通过降低SUN含量来延缓疲劳的产生。黑豆肽低、中、高剂量组的肝糖原(HG)含量与空白对照组都具有极显著差异(P＜0.01)，由此可判定低、中、高剂量组结果均为阳性，能显著增加肝糖原的储备，从而延缓体力疲劳的发生。GSH阳性对照组的血乳酸和血清尿素氮2项生化指标均与空白对照组差异不显著，而HG含量指标则均与空白对照组差异极显著(P＜0.01)，表明其BLA、SUN和HG水平与低剂量黑豆肽组基本相当。

2.3 抗氧化与缓解体力疲劳黑豆肽的相对分子质量分布与氨基酸组成

2.3.1 抗氧化与缓解体力疲劳黑豆肽的相对分子质量分布

图 1 缓解体力疲劳黑豆肽的Sephadex G-25分离图谱Fig.1 Sephadex G-25 chromatogram of anti-fatigue BSPs

由图1可知，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱对抗氧化与缓解体力黑豆肽(BSP)进一步分离共得到4个洗脱峰组分，各洗脱峰组分比例、相对分子质量分布与DPPH自由基清除率见表5。P1和P4峰的DPPH自由基清除能力很弱，P1组分可能是一些水解度较低的大分子肽，P4组分可能是一些水解过度的游离氨基酸；P2、P3峰组分的DPPH自由基清除能力较强，其中P3峰为主要组分，占64.4%，且DPPH自由基清除率最高，表明具有抗氧化、缓解体力疲劳功能的黑豆肽主要是一些相对分子质量约在450～920之间的小肽。

表 5 缓解体力疲劳黑豆肽的Sephadex G-25分离图谱分析Table 5 Results of chromatographic separation of anti-fatigue BSP on Sephadex G-25

2.3.2 抗氧化与缓解体力疲劳黑豆肽的氨基酸组成

据相关研究报道[22-23]，抗氧化肽多数是一些由3～7个氨基酸所组成的小肽，多肽链中的疏水性氨基酸和Tyr、Cys及His等可以提高肽的抗氧化能力，且抗氧化较强的小分子肽可以延缓自由基引发的疲劳。由表6可知，大孔树脂吸附的75%乙醇洗脱黑豆肽组分的疏水性氨基酸含量较相对分子质量＜3000的超滤组分明显增加，特别是Phe、Val、Pro和Met等增加幅度较大，且中性极性氨基酸Thr、Cys和碱性氨基酸His等含量也有所增加，因而具有较强的抗氧化活性和缓解体力疲劳功能，这一结果与刘晶等[24]的研究报道一致。Sephadex G-25分离P3组分的疏水性氨基酸含量与大孔树脂吸附的75%乙醇洗脱黑豆肽组分基本接近，Tyr、Cys略有增加，尤其是His增加幅度较大，且相对分子质量较小，因而表现出更强的抗氧化活性，其缓解体力疲劳作用是否更强，有待于进一步研究。

表 6 黑豆肽的氨基酸组成Table 6 Amino acid composition of black soybean peptides g/100g

3 结 论

通过超滤和DA201-C大孔树脂对黑豆蛋白酶法水解产物进行分离纯化，相对分子质量＜3000，以体积分数75%乙醇洗脱的黑豆肽具有相对最强的体外抗氧化活性。将该黑豆肽进行缓解体力疲劳动物实验，中、高剂量组小鼠负重游泳时间、运动后血乳酸和肝糖原含量与空白对照组均具有极显著差异(P＜0.01)，由此判定抗氧化黑豆肽具有缓解体力疲劳功能的作用。中剂量组(500mg/(kg·d))小鼠负重游泳时间、提高运动耐力的效果与GSH阳性对照组(50mg/(kg·d))水平相当，低剂量组(250mg/(kg·d))小鼠血乳酸、肝糖原含量，减少运动时小鼠血乳酸积累、增加肝糖原储备的作用与GSH阳性对照组水平相当，说明实验获得的黑豆肽达到缓解体力疲劳同等效果的灌胃剂量约需GSH的5～10倍。

相对分子质量分布和氨基酸组成分析表明，抗氧化黑豆肽主要是一些相对分子质量约在450～920之间的小肽，具有Phe、Val、Pro、Met等疏水性氨基酸和抗氧化较强的Thr、Cys、His等含量较高的氨基酸组成特点，可以延缓由自由基引发的疲劳。

[1] 丛建民. 黑豆的营养成分分析研究[J]. 食品工业科技, 2008, 29(4)： 262-264.

[2] 张瑞芬, 池建伟, 丘银清, 等. 黑大豆的营养及保健功能研究进展[J]. 广东农业科学, 2006(11)： 13-16.

[3] 黎观红, 晏向华. 食物蛋白源生物活性肽：基础与应用[M]. 北京： 化学工业出版社, 2010.

[4] 江连洲, 赵谋明, 陈复生, 等. 大豆精深加工关键技术创新与应用[J]. 中国食品学报, 2012, 12(6)： 1-8.

[5] 杨少玲, 李来好. 抗疲劳肽的研究现状[J]. 湛江海洋大学学报, 2006, 26(6)： 77-82.

[6] 曹海信, 赵启权, 李世明. 生物自由基与运动性疲劳的研究进展[J]. 四川体育科学, 2006, 12(4)： 33-35.

[7] STIENEN G J, ROOSEMALEN M C, WILSON M G, et al. Depression of force by phosphate in skinned skeletal muscle fibers of the frog[J]. Am J Physiol, 2005, 259： C349-C357.

[8] DILLARD C J, LITOV R E, SAVIN W M, et al. Effect of exercise, vitamin E, and ozone on pulmonary function and lipid peroxidation[J]. J Appl Physiol, 1978, 45： 927-932.

[9] 陈园园. 大豆肽的酶解制备与抗疲劳、抗氧化功能研究[D]. 无锡： 江南大学, 2008.

[10] 王勇刚, 朱锋荣, 韩福森, 等. 鱼精多肽在抗氧化和抗疲劳方面的作用研究[J]. 食品科技, 2007(7)： 245-248.

[11] 王玲琴, 王志耕, 方玉明, 等. 双酶法制备大豆降胆固醇活性肽的研究[J]. 大豆科学, 2010, 29(1)： 109-112.

[12] 刘恩岐, 贺菊萍, 陈振家, 等. 黑豆蛋白质酶水解物体外抗氧化活性的研究[J]. 中国粮油学报, 2009, 24(11)： 38-41.

[13] 任娇艳, 赵谋明, 崔春, 等. 草鱼蛋白源抗氧化肽的分离及鉴定[J]. 食品科学, 2009, 30(13)： 13-17.

[14] 钟芳, 张晓梅, 麻建国. 大豆肽的大孔吸附树脂以及凝胶过滤色谱分离[J]. 食品与机械, 2006, 22(4)： 25-28.

[15] 张晓梅, 钟芳, 麻建国. 大豆降胆固醇活性肽的初步分离纯化[J]. 食品与机械, 2006, 22(2)： 33-36.

[16] 胡丰林, 陆瑞利, 黄勃, 等. 一种被毛孢(Hirsutella sp.)培养液中自由基清除剂的分析、分离和制备[J]. 微生物学报, 2008, 48(8)： 1035-1041.

[17] 李茂辉, 叶丽杰, 卢桂华, 等. 心肌多肽抗疲劳效应的实验研究[J]. 现代预防医学, 2006, 33(7)： 1097-1099.

[18] 方富永, 苗艳丽, 程诚, 等. 翡翠贻贝肉复合酶解物的抗疲劳作用[J]. 中国食品学报, 2012, 12(11)： 20-23.

[19] 中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范[M]. 北京, 2003： 87-93.

[20] 施佳慧, 朱加进, 陈文聪, 等. 鲐鲅鱼水解产物抗疲劳作用效果研究[J]. 中国食品学报, 2010, 10(6)： 77-80.

[21] 张君慧, 张晖, 王兴国, 等. 抗氧化活性肽的研究进展[J]. 中国粮油学报, 2008, 23(6)： 227-233.

[22] CHEN Guitang, ZHAO Lin, ZHAO Liyan, et al. in vitro study on antioxidant activities of peanut protein hydrolysate[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87(2)： 357-362.

[23] POULIOT Y, WIJERS M C, GAUTHIER S F, et al. Fractionation of whey protein hydrolysates using charged UF/NF membranes[J]. Journal of Membrane Science, 1999, 158(1/2)： 105-114.

[24] 刘晶, 温志英, 韩清波. 米渣肽抗疲劳作用及抗疲劳肽的分离鉴定[J]. 中国粮油学报, 2013, 28(1)： 1-4.