陈小举，姜绍通*，李兴江，潘丽军

(合肥工业大学农产品加工研究院，生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

乳酸和琥珀酸广泛应用于食品、化工和医药等产业[1-2]。随着时代的发展，人类越来越注重环境的保护，生物可降解材料的制备也因此受到了极大的关注[3-4]。作为聚乳酸和聚琥珀酸丁二酯的合成前体，乳酸和琥珀酸的生产一直是研究的热点。目前，主要通过化学方法制备琥珀酸，但化学法制备琥珀酸会对环境造成污染，使其广泛应用受到了限制[5]。近年来，微生物转化再生资源制备琥珀酸的方法倍受重视。通过微生物转化可再生资源和CO2制备琥珀酸，不仅可以摆脱对石化原料的依赖，而且还能开辟利用温室气体CO2的新途径。工业规模的微生物转化可再生资源和CO2制备琥珀酸将成为一个最具发展潜力的绿色工艺模式[6]。

本研究小组在前期的研究中发现，将钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)在厌氧环境下进行培养时产生的代谢物为主要乳酸和琥珀酸。与乳酸相比，琥珀酸的产量较低，无法做到联产乳酸和琥珀酸。在厌氧环境下，与C. crenatum基因同源性很高的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)主要利用两种途径生产琥珀酸(图1)：第一条途径为C4途径，即由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸，然后再通过TCA循环的还原途径(由草酰乙酸经苹果酸、富马酸到琥珀酸)产生琥珀酸；第二条途径为乙醛酸循环[7]。其中，第一条途径为生产琥珀酸的主要途径，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是这个途径中的关键酶，其酶活的高低对PEP节点处碳代谢流的分布有较大的影响。PEPC是一种羧化酶，可将PEP催化生成草酰乙酸，此反应须固定一分子CO2。改变发酵体系中CO2的浓度及其供应方式会对PEPC的活性和PEP节点处的代谢流分布产生影响，进而实现调控羧化反应下游产物的生成，如琥珀酸等[8]。钝齿棒杆菌代谢模型中包括的生化反应方程如表1所示。

图 1 厌氧条件下钝齿棒杆菌的代谢网络Fig.1 Metabolic networks of C. crenatum under anaerobic conditions

通过向发酵体系中加入碳酸氢钠，可以为C. crenatum提供羧化反应所需的CO2，强化羧化反应的进行，进而调节乳酸和琥珀酸的生成比，达到增加琥珀酸产量的目的及实现乳酸和琥珀酸的联产。代谢通量分析是代谢工程研究中最重要的一种手段和方法[9]。本实验在代谢途径分析及代谢通量计算的基础上，调控C. crenatum细胞内PEP节点处的代谢流分布，调节乳酸和琥珀酸的生成比，为利用C. crenatum转化可再生资源联产乳酸和琥珀酸提供数据支持。

表 1 钝齿棒杆菌代谢模型中包括的生化反应方程Table 1 Metabolic reactions in C. crenatum metabolic networks

1 材料与方法

1.1 菌株

Corynebacterium crenatum CICC20219 本实验室保藏。

1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖40g/L、尿素2g/L、酵母提取物2g/L、酪蛋白氨基酸7g/L、(NH4)2SO47g/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 6mg/L、MnSO4·H2O 4.2mg/L、生物素0.2mg/L、硫胺素0.2mg/L。

发酵培养基：葡萄糖48g/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 6mg/L、MnSO4·H2O 4.2mg/L、生物素0.2mg/L、硫胺素0.2mg/L。加入NaHCO3，使浓度分别为0、10、100、200mmol/L。

1.3 仪器与设备

ELSD 2424、UV 2996高效液相色谱系统、糖检测色谱柱 美国Waters公司；有机酸检测色谱柱 德国Merck公司；GA92-ⅡD超声波细胞破碎机 无锡上佳生物技术公司。

1.4 培养方法

挑取单菌落C. crenatum接种于含30mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃、200r/min培养12h。然后以10%的接种量转接于含1.5L种子培养基的3L发酵罐中，30℃、300r/min培养10h，通气量为2.0L/(L·min)，pH值为7.5，中和剂为5mol/L NaOH。然后5000r/min、4℃离心10min，去掉上清液收集菌体。将收集后的菌体接种于含1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，使生物量为10g/L左右，通入氮气，持续5min。然后密封发酵罐，30℃、150r/min厌氧发酵，pH值为7.2，中和剂为5mol/L NaOH。每组实验均重复3次。

1.5 检测方法

将发酵液样品于4℃、10000r/min离心10min，取上清液用于糖、有机酸等物质的分析。糖和有机酸均采用高效液相色谱法(HPLC)分析。糖检测色谱柱为Carbohydrate Analysis (3.9mm×300mm)，采用蒸发光检测器ELSD2424，流动相为75%乙腈，流速1.000mL/min。有机酸检测色谱柱为Purospher STAR C18(250mm×4.6mm，5μm)，采用紫外检测器UV2996，流动相为5mmol/L H2SO4，流速为1.000mL/min。每组数据测3次，实验误差在5%以内。

1.6 生物量测定

生物量以OD610nm表示。细胞干质量(DCW)采用恒质量法测定[10]。

1.7 酶活力检测

取1mL发酵培养菌悬液于4℃、10000r/min离心10min获得菌体，用含15%甘油的Tris-HCl (50mmol/L，pH 7.5) 洗涤2次，使用超声波细胞破碎机冰浴超声90次(超声2s/间隔5s)，功率为200W。4℃、10000r/min冷冻离心15min，上清液即为原始粗酶液。

PEPC酶活力的检测方法如文献[11]所述。一个酶活力单位(1U)定义为每分钟催化1μmol/L底物所需要的酶量，单位为U/mg。

1.8 蛋白质含量检测

总蛋白质含量的测定采用Bradford法[12]。

1.9 代谢通量计算

代谢网路的建立：因为关于C. crenatum代谢网路的相关文献资料鲜见，尤其在厌氧条件下的代谢特征更无相关报道。因此，本实验参照与C. crenatum基因同源性高达99%的C. glutamicu的代谢网络[7,13-14]，构建其代谢网络模型，如图1所示。

代谢流计算：在代谢流计算过程中，统一取发酵时间为1～3h时间段的发酵液进行代谢分析。在此时间段内，其代谢产物的生成速率比较稳定，而且这一部分时间内的平均值与细胞总体发酵的平均值比较接近，各个发酵批次之间重现性好，所以统一考察该时间段变量。在代谢产物精确检测的条件下，结合C. crenatum在厌氧条件下的主代谢途径，能够推测出其代谢过程，并且利用拟稳态假设的方法，可以求出各个途径的代谢通量。

化学计量平衡式列于附录。节点数(变量)为27个，方程数为22个，方程自由度5，需要测定5个变量方可计算代谢网络中的代谢流分布。在C. crenatum厌氧发酵条件下，本实验离线检测胞外代谢物为葡萄糖、乳酸、琥珀酸、乙酸和丙酮酸。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3对C. crenatum产酸的影响

本实验细致研究了NaHCO3对葡萄糖消耗速率、乳酸和琥珀酸生成速度及其产量的影响。由图2和表2、3可以看出，厌氧条件下，NaHCO3的加入虽然没有改变发酵体系中C. crenatum的细胞干质量，却对葡萄糖消耗速率产生了显著的影响，结果显示加入NaHCO3能明显加快葡萄糖的消耗速率。当NaHCO3浓度为100mmol/L时，葡萄糖的消耗速率达到了69.14mmol/(L·h)，与NaHCO3为0mmol/L时相比增加了130%。然而继续增大NaHCO3的浓度，葡萄糖的消耗速率开始略微下降。

表 2 NaHCO3对钝齿棒杆菌产酸的影响Table 2 Effects of sodium bicarbonate on organic acids production by C. crenatum

乳酸与琥珀酸等有机酸的生成速率和最终产量在加入NaHCO3后也发生了明显的变化，而乳酸和琥珀酸的总酸产量一直在1.9mol/mol(表示每消耗1mol葡萄糖所产生的有机酸物质的量)左右，表明消耗的糖都被转化为乳酸和琥珀酸。由于NaHCO3的加入加快了葡萄糖的消耗速率，有机酸的生成速率也随之加快。当NaHCO3浓度为100mmol/L时，乳酸的生产速率达到最大，为100.88mmol/(L·h)，是碳酸氢钠浓度为0mmol/L时的1.86倍。同时，乳酸的积累浓度也达到最大，为400mmol/L，与NaHCO3为0mmol/L时相比升高了84%，而乳酸产量却由1.84mol/mol下降到1.48mol/mol。继续增大碳酸氢钠的浓度，乳酸的积累浓度开始下降。与乳酸不同的是，随着NaHCO3浓度的不断增大，琥珀酸的生产速率也随之越来越快。当NaHCO3浓度为200mmol/L时，琥珀酸的生产速率达到了30.51mmol/(L·h)。琥珀酸的最终积累浓度为128.05mmol/L，是NaHCO3为0mmol/L时的9.2倍，琥珀酸产量也由0.14mol/mol升高到0.49mol/mol。同时，随着NaHCO3浓度的不断增大，发酵液中产生的琥珀酸与乳酸的物质的量比也在不断增大，由最初的0.08mol/mol上升到0.34mol/mol。结果表明，向发酵体系中加入NaHCO3可以调节乳酸和琥珀酸的产量，增加琥珀酸与乳酸的生成比，为最终实现乳酸与琥珀酸的联产奠定了基础。

表 3 不同NaHCO3浓度下葡萄糖消耗速率与有机酸产生速率Table 3 Glucose consumption rate and organic acids production rate in the presence or absence of sodium bicarbonate

图 2 NaHCO3对钝齿棒杆菌产酸的影响Fig.2 Effects of sodium bicarbonate on the yield of organic acids in C. crenatum

2.2 NaHCO3对C. crenatum代谢通量的影响

分析图1的网络代谢模型可以看出，C. crenatum主要利用两条途径产琥珀酸：C4途径和乙醛酸循环。通过代谢流分析，研究在NaHCO3加入后细胞内代谢通量的变化，能更深入的了解2种途径在琥珀酸合成方面的作用，为进一步提高琥珀酸产量提供更有力的理论依据。

研究发现，加入NaHCO3能增加琥珀酸的产量。为了探寻NaHCO3改变C. crenatum细胞内碳代谢流分布、增加琥珀酸产量的机理，本实验分析比较了C. crenatum在NaHCO3浓度为0mmol/L和100mmol/L时代谢通量的变化，并对计算结果进行了归一化处理，代谢通量数据单位为mmol/(L·g·h)。由于C. crenatum在厌氧情况下停止了生长，因此在代谢通量计算过程中忽略了生物质的影响。

表 4 不同NaHCO3浓度下关键节点的代谢流变化Table 4 Metabolic flux rate of C. crenatum at key points in the presence or absence of sodium bicarbonate

图 3 NaHCO3浓度为0mmol/L(a)和100mmol/L(b)时的钝齿棒杆菌代谢通量分布Fig.3 Metabolic flux distribution in C. crenatum in the presence of 0 mmol/L and 100 mmol/L of sodium bicarbonate

由表4和图3a、b可知，C. crenatum消耗的葡萄糖主要用于乳酸的生成，其次是琥珀酸。加入NaHCO3后，Glu-6-P节点处的代谢流分布发生了较大的变化。戊糖磷酸途径(HMP)得到了加强，代谢通量由9.7mmol/(L·g·h)增加到35.3mmol/(L·g·h)。理论上每消耗1mol葡萄糖可产生2mol琥珀酸，需要4mol NADH，而每摩尔葡萄糖经由EMP途径只产生2mol的NADH[15]。NADH的不足限制了C. crenatum利用C4途径生产琥珀酸。因此，细胞在NADH不足的情况下强化了HMP途径，使更多的碳源流向HMP途径，因为每摩尔葡萄糖经HMP途径后再回到EMP途径可多产生2mol的NADPH。多产生的NADPH又可以用于生成更多的琥珀酸。

PEP节点处的碳代谢流也重新进行了分布。由PEP到丙酮酸(Pyr)的碳流量流减少18.9%，而流向草酰乙酸(OoA)的碳流量增加了2倍(表3)，因此，丙酮酸下游代谢物通量(乳酸、乙酸)出现了不同程度的下降，但乳酸仍为主要产物。代谢通量计算结果表明(表4、图3)，C4途径在产琥珀酸的过程中起主导作用，经由C4途径产生的琥珀酸占整个琥珀酸产量的96%。

PEPC是C. crenatum细胞内的主要羧化酶，其催化的反应过程需要CO2的参与。NaHCO3溶于水后会以CO2-HCO3－的形式存在，提高了溶液中的CO2浓度，可以使更多的CO2参与PEPC催化的羧化反应。因此，CO2可利用浓度的高低会直接影响PEPC的酶活。有研究表明，利用Anaerobiospirillum succiniciproducens厌氧发酵产琥珀酸时，提高发酵液中CO2的可利用浓度能增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的酶活，使更多的碳源流向C4途径，增加琥珀酸产量[16]。为了验证是因为NaHCO3的加入而导致PEPC酶活性的提高，进而使PEP节点处的碳代谢流重新进行了分布，并对PEPC的酶活进行了测定。

由表4可知，加入NaHCO3后，PEPC的酶活力由0.956U/mg升高到1.242U/mg。增强的PEPC酶活可能打破了PEP节点处的代谢流平衡，并重新分配了此节点处的代谢流，而将更多的碳代谢流引向C4途径，从而使细胞分泌更多的琥珀酸。其次，高酶活的PEPC可以将PEP快速地转化为下游代谢物，减少细胞内的PEP积累量。由于PEP会对磷酸果糖激酶产生反馈抑制，进而影响糖酵解的速率[17]，因此，NaHCO3的加入可以使PEP快速的转化为下游产物，解除了PEP对对磷酸果糖激酶产生的反馈抑制，使糖酵解能顺利的运行下去。

3 结 论

本实验研究了NaHCO3对C. crenatum厌氧发酵产琥珀酸的影响，并对代谢流进行了分析。NaHCO3溶解在发酵体系中可以为PEPC提供羧化反应所需的CO2，因此添加不同浓度的NaHCO3会对PEP节点代谢流分布产生影响，进而改变胞外代谢产物的积累浓度。加入NaHCO3能加快C. crenatum利用葡萄糖的消耗速率，提高PEPC的酶活，使PEP节点的碳代谢流分布发生变化，使更多的碳源流向C4途径，增加琥珀酸的产量，增加乳酸和琥珀酸的生成比，为利用C. crenatum转化可再生资源联产乳酸和琥珀酸奠定了基础。下一步将对C. crenatum厌氧发酵联产乳酸和琥珀酸进行发酵工艺优化，循环利用C. crenatum菌体进行多批次发酵，提高生成效率，降低生产成本。

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