帕尔哈提·柔孜，阿依姑丽·艾合麦提*，朱 昆，刘 璐，胡 月，何文婷

(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

自由基与许多病理生理现象都有密切的关系，如衰老、肿瘤、炎症、突变、心脑缺血、动脉粥样硬化、帕金森病等[1-3]。抗氧化剂的抗氧化作用可以通过抑制自由基的产生，或直接清除自由基，甚至可以通过提高内源性抗氧化物质的水平来实现。因而体内维持一定水平的抗氧化剂，可延长寿命和推迟衰老。外加一些抗氧化剂协助体内维持氧代谢的平衡，对于防止疾病的发生和保持机体的健康是十分有益的。因此从天然产物中寻找高效、价廉、低毒具有抗氧化、清除自由基功能的化合物的研究工作就变得十分重要[4-5]。

和田玫瑰又名粉玫瑰，由于和田特殊的地理气候环境，使得和田玫瑰花瓣期长，花瓣朵大出油率高，是不可多得的优良品种。和田玫瑰具滋补肠胃、改善消化、芳香开窍、安神止痛、软肠通便、润肤生辉等[6]多种效果。维吾尔民间常将玫瑰花酱用于胸胁胃脘胀痛以及消化不良、月经不调等症，玫瑰花瓣常用于泡茶，进行全身玫瑰浴。目前，对和田玫瑰的研究主要限于玫瑰红色素的提取[7]、玫瑰花酱[8]和玫瑰花茶的制作及应用上，对和田玫瑰花瓣的化学成分以及营养成分与抗氧化方面的研究在国内少见报到。本实验通过提取玫瑰花瓣中的总黄酮类和总多糖成分，研究其体外的抗氧化活性，以期为和田玫瑰的综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

玫瑰花瓣2011年6月采自于新疆和田地区墨玉县，凭证标本存于新疆农业大学食品科学与药学院生药实验室。

雄性昆明系小鼠，体质量(20±2)g，购自新疆医科大学实验动物中心。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司；芦丁 中国药品生物制品检定所提供；葡萄糖、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸亚铁、双氧水、邻苯三酚、乙醇、三氯化铝、浓硫酸、水杨酸、苯酚均为国产分析纯。

UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；HH-4恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；BT 25S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒实验仪器有限公司；精密pH仪 上海精科雷磁仪器厂；RE-52型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰花瓣总黄酮的提取[9]

准确称取玫瑰花瓣粉末10g，用75%的乙醇以料液比1：15在室温下用超声波提取，提取时间40min，减压回收乙醇，在烘箱中60℃干燥，即得玫瑰花瓣总黄酮，并测定其提取率，按式(1)计算。

1.2.2 玫瑰花瓣总多糖的提取[10]

准确称取玫瑰花瓣干粉末10g，用蒸馏水以料液比1：15(m/V)，过夜浸提，在室温下用超声波提取，提取时间1h，过滤，滤液减压浓缩到原来体积的1/5倍，加入5倍量的无水乙醇混合放置过夜，抽滤后的沉淀用100mL水溶解重复醇沉1次。过滤沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，在烘箱中60℃烘干，即得玫瑰花瓣总多糖，并测定其提取率，按式(2)计算。

1.2.3 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖的含量测定

总黄酮含量的测定采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[11]，标准曲线为y=13.4x+0.0548(R2=0.9999)，其中：x为吸光度，y为提取液中总黄酮质量浓度/(mg/mL)，检测波长510nm，以芦丁来计算，并测定其相对含量，相对含量按式(3)计算。

式中：c为根据标准曲线计算的黄酮含量/mg；N为稀释倍数；m为总黄酮提取物的质量/g。

总多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[12]，标准曲线为y=12.919x＋0.0488(R2=0.9982)，其中：x为总多糖质量浓度/(mg/mL)，y为吸光度，检测波长490nm，以葡萄糖来计算，并测定其相对含量，相对含量按式(4)计算。

式中：c为根据标准曲线计算的总多糖含量/mg；N为稀释倍数；m为总多糖提取物的质量/g。

1.2.4 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖抗氧化活性的测定

1.2.4.1 对·OH清除率测定

利用Fenton反应体系产生·OH[13]，依次加入6mmol/L FeSO4溶液、6mmol/L 水杨酸溶液各2mL，分别加入2mL不同质量浓度的玫瑰花总黄酮(25、50、100、150、200、250μg/mL)和总多糖溶液(25、50、100、150、200、250μg/mL)，最后加入6mmol/L的H2O2溶液2mL启动反应，静置30min后于波长510nm处测其吸光度，以蒸馏水代替样品溶液做空白，并以同质量浓度的VC作阳性对照，·OH清除率按式(5)计算。

式中：A0为空白吸光度；Ax为样品吸光度。

1.2.4.3 对DPPH自由基清除率的测定

利用DPPH无水乙醇溶液在波长517nm处紫色团的特定吸收峰[15]，测定加抗氧化剂后，在波长517nm处吸光度的下降表示其对DPPH自由基的清除能力。

具塞试管中加入2mL 2×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液，再分别加入2mL不同质量浓度的总黄酮、总多糖、VC的无水乙醇溶液，混均，在室温下30min后，于波长517nm处测吸光度AI，同时测定2mL 2×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL 50%乙醇混合液的吸光度A0，取2mL不同质量浓度的总黄酮、总多糖，VC与50%乙醇混合液测定吸光度AJ。DPPH自由基的清除率按式(7)计算。

1.2.4.4 对小鼠肝自发生脂质过氧化能力测定

利用硫代巴比妥酸法[16]，小鼠禁食12h后处死，取肝，在0～4℃条件下用生理盐水制成5%肝匀浆。实验分为对照组(肝匀浆和蒸馏水)、阳性组(肝匀浆和VC)、6个不同剂量的玫瑰花瓣总黄酮组(肝匀浆和总黄酮)和6个不同剂量的玫瑰花瓣总多糖组(肝匀浆和总多糖)。先在各管中分别加入肝匀浆1.0mL，然后在6个剂量组中分别加入(0.1、0.5、1、2、4、8mg/mL)提取物0.1mL，对照组加入蒸馏水0.1mL，阳性组加1mg/mL VC 0.1mL。将各组37℃水浴反应60min(振荡)，取出，将试管流水冷却，向各试管加入20%三氯醋酸(TCA)1mL，0.67%硫代巴比妥酸(TBA)1mL，混匀，沸水浴15min(振荡)取出流水冷却。然后3000r/min离心，取上清液在波长532nm处测吸光度，并计算抑制率。每组实验均设5个平行管，实验重复2次。抑制过氧化能力按式(8)计算。

式中：A0为空白吸光度；Ax为样品吸光度。

1.2.5 统计分析

2 结果与分析

2.1 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖含量测定结果

表 1 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖的含量Table 1 Contents of total flavonoids and total polysaccharides in rose petals

由表1可知，玫瑰花瓣中总黄酮和总多糖的提取率分别为52.1%、73.3%，含量分别为3.45、5.22mg/mL，制备物中总黄酮和总多糖的相对含量分别为51.75、78.30mg/g。

2.2 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖对·OH的清除作用

由图1可知，玫瑰花总黄酮和总多糖随着质量浓度的增加，清除·OH的能力不断提高。根据清除率与质量浓度的线性关系：总黄酮为y=11.325x+25.001(R2=0.9935)，总多糖为y=12.385x+15.594(R2=0.9951)；VC为y=10.038x+23.955(R2=0.9946)；通过线性方程计算得出总黄酮、总多糖及VC的IC50分别为2.21、2.78、2.59μg/mL 。其中总黄酮对·OH的清除能力较VC为强，由此可见，玫瑰花瓣总黄酮和总多糖有较好的清除·OH能力。

图 1 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖对·OH的清除作用Fig.1 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on hydroxyl free radicals

2.3 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖对O2¯·的清除作用

图 2 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖对·的清除作用Fig.2 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on superoxide anion free radicals

2.4 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖对DPPH自由基的清除作用

图 3 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on DPPH free radicals

由图3 可知，玫瑰花总黄酮和总多糖随着质量浓度的增加，清除D P P H 自由基的能力不断提高。根据清除率与质量浓度的线性关系：总黄酮为y=1 2.7 7 5 x ＋2 5.7 5 5(R2=0.9 8 8 5)；总多糖为y=13.371x＋4.0113(R2=0.9933)；VC为y=10.849x＋25.755(R2=0.9885)，通过线性方程计算得出总黄酮、总多糖及VC的IC50分别为2.54、3.44、2.24μg/mL。其中总多糖清除DPPH自由基能力较VC略强，由此可见，玫瑰花瓣不同提取部位物有较好的清除DPPH自由基能力。

2.5 玫瑰花瓣总黄酮和总多糖抑制脂质过氧化的作用

表 2 玫瑰花瓣总黄酮对脂质过氧化的抑制率Table 2 Anti-lipid peroxidation activity of total flavonoids from rose petals

由表2可知，玫瑰花瓣总黄酮对小鼠肝自发性脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的生成有一定的抑制作用，且抑制率与质量浓度呈现量效关系，玫瑰花瓣总黄酮的2、4、8mg/mL组与VC组相比能极显著抑制小鼠肝自发性脂质过氧化过程(P＜0.01)。

表 3 玫瑰花瓣总多糖对脂质过氧化的抑制率Table 3 Anti-lipid peroxidation activity of total polysaccharides from rose petals

由表3可知，玫瑰花瓣总多糖对小鼠肝自发性脂质过氧化产物MDA的生成有一定的抑制作用，且抑制率与质量浓度呈现量效关系，玫瑰花瓣总多糖的0.5、1、2、4、8mg/mL组与VC组相比能极显著抑制小鼠肝自发性脂质过氧化过程(P＜0.01)。

3 结 论

玫瑰花总黄酮和总多糖具有较强的抗氧化性能，并且随着质量浓度的增加，其抗氧化性能亦不断增强，呈现了良好的量效关系。总黄酮清除自由基的能力均强于总多糖，但是总黄酮抑制脂质过氧化作用却弱于总多糖。有关和田玫瑰花不同部位提取物的抗氧化作用，值得进行进一步研究。

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