刘志刚，吴 彦，孙青松

（1.安庆师范学院生命科学院，安徽安庆246011；2.吉林大学人兽共患病研究所教育部重点实验室，吉林长春130062）

华支睾吸虫病是一种人兽共患寄生虫病，由于其成虫寄生于人、猫、犬等动物的胆囊和胆管内，可引起胆管及其周围组织的炎症反应诱发肝硬化、原发性肝癌等严重病变［1-8］。目前，华支睾吸虫的研究主要集中在形态学、流行病学和病原鉴定等方面，对其不同发育阶段主要集中在成虫或囊蚴的研究，而对华支睾吸虫虫卵的研究甚少，虫卵的研究只限于形态学研究。本试验利用聚合酶链反应（PCR）检测人粪便中的虫卵诊断人是否患有华支睾吸虫病，为进一步探索PCR技术在华支睾吸虫病诊断中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪样 来自安徽省芜湖县流行区村民新鲜粪便。

1.1.2 仪器 Gene Amp PCR systerm 9700，AB公司产品；AR1140电子天平，USA奥豪斯公司产品；PY-120水平脱色摇床，北京鼎国生物技术发展中心产品；CX31RTSF生物显微镜，Olympus公司产品；NANODROP2000，Thermo公司产品；水浴锅，超净工作台，磁力搅拌器，振荡器，组织匀浆机。

1.1.3 主要试剂 20mL／L Triton X-100，KOH，蔗糖／KCl溶液，PCR 扩增 试剂，T 载体，DNA Marker，琼脂糖，DNA凝胶回收试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 粪便的收集与保存 镜检粪便发现华支睾吸虫虫卵，初步确定为阳性粪便，需要进一步鉴定。

1.2.2 虫卵DNA的提取 参考Boris Müller［9］并进行适当的改进。

将冰冻的含虫卵的粪便样品取出，于清水中融化，放入沸水中煮6min，10 000r／min离心6min，去除少量上清后，将所有液体移入2mL的EP管中，并重悬；将2mL的EP管放入沸水中煮5min，10 000r／min离心5min；去上清，计算管内样品重量，各管分别加入20mL／L Triton X-100，KOH各200μL，振荡器震荡混匀，10 000r／min离心5min，去上清，反复进行此过程，直至上清变清澈；去上清，每管加入800μL蔗糖／KCl溶液，并充分震荡均匀后，12 000r／min离心10min；将上清移入新的2 mL EP管中，加满水，12 000r／min离心10min，去上清，重复加满水，清洗沉淀，最后残留300μL沉淀物及液体；用组织匀浆机匀浆残留的沉淀物及液体，10 000r／min离心1min，每管；最后10 000r／min离心5min，留取上清，移入新管中，沸水煮5min，作为PCR模板。

1.2.3 引物的设计与PCR条件的优化 根据华支睾吸虫基因（AF217094）设计引物，上游引物Cs1：5′-TGGCCTGACTGGCTGGCCGG-3′，下 游 引 物Cs2： 5′-CGGCACCCCACACACATACA-3′， 用Primer 5.0分析软件分析其可行性，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应体系为：10×PCR buffer液（含Mg2＋），2mmol／L dNTP，10pmol／L上、下游引物，DNA模板，5U／μLTaqDNA聚合酶，灭菌去离子水混至50μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃～60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃结束反应。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳缓冲液为0.5×TBE，加入少许溴化乙锭（EB）使其终浓度为0.5 μg／mL。将上样缓冲液与扩增产物以1∶6的比例混匀，加样至样品孔中，以DNA Marker为标准分子量。用5V／cm的电压进行电泳，当溴酚蓝至适当位置后，切断电源，在紫外投射反射仪上观察电泳结果并拍照。

1.2.5 连接载体与基因测序 将PCR扩增产物大量回收，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA，与T载体连接后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定，应用NCBI中的BLAST工具将测序结果与基因库内的基因序列进行比对并进行同源性分析。

2 结果

2.1 虫卵镜检结果

显微镜下可看见黄褐色虫卵，前窄后钝，形似芝麻粒。一端有明显的卵盖，盖侧有稍厚隆起的肩峰，对端有1个疣状小结节，卵内含1个梨形的毛蚴。

2.2 PCR优化结果

分别对PCR反应体系中的dNTP量，模板量，引物量和TaqDNA聚合酶用量进行优化，选择最佳结果（表1）；拟在55℃～60℃的区间内，对退火温度进行摸索。结果最佳反应条件为：94℃预变性5 min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃结束反应。用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，鉴定成功后回收，用15g／L琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。检测结果显示，除阴性对照未见条带外，其余各样本均可扩增出大小约为255bp的特异性条带（图1、图2）。

表1 优化后的PCR反应体系Table 1 The optimized PCR system

图1 PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification results

图2 回收产物鉴定结果Fig.2 The identification results of recovered products

2.3 基因序列对比结果

扩增产物的测序结果应用BLAST工具进行比对后，发现其与华支睾吸虫基因的内转录间隔区2（ITS2）：中国沈阳分离株（AF217099）和朝鲜分离株（AF217094）的同源性为100%，证实扩增产物为华支睾吸虫基因的其中一个片段。

3 讨论

华支睾吸虫虫卵比较小，不易检查，容易漏诊，目前主要依靠显微镜形态学观察，免疫学诊断方法最近几年有了快速的发展，具有高特异性、高敏感性、简便易行等优势，然而由于华支睾吸虫抗原的复杂性以及不同发育时期转录与表达产物的不同，致使高特异性及高敏感性抗原至今尚未寻找到，从而使这一优势诊断方法始终未应用到临床诊断中。

近年来，随着分子生物学的发展，聚合酶链反应（PCR）因其较高的敏感性、特异性以及能够提供病原体在体内存在的直接证据，在其诊断中展示了广阔的应用前景［10-11］。本试验应用PCR技术检测粪便中华支睾吸虫虫卵DNA，因粪便中干扰因素较多，故基因组DNA的成功提取以及稳定的PCR反应体系的建立便成为开展该方面研究的前提，同时探索PCR检测法的敏感性，为进一步探索分子生物学方法在华支睾吸虫病诊断中的应用奠定基础。

［1］ Traub R J，Macaranas J，Mungthin M，et al.A new PCR-based approach indicates the range ofClonorchissinensisnow extends to central Thailand［J］.PLoS Negl Trop Dis，2009，3（1）：e367.

［2］ Kim E M，Kim J L，Sung Y C，et al.Infection status of freshwater fish with metacercariae ofClonorchissinensisin Korea［J］.Korean J Parasitol，2008，46（4）：247-251.

［3］ 唐 颖，路义鑫，韩彩霞.等 东北地区华支睾吸虫ITS1基因序列分析［J］.中国预防兽医学报，2011，33（5）：405-407.

［4］ Lun Z R，Gasser R B，Lai D H，et al.Clonorchiasis a key foodborne zoonosis in China［J］.Lancet Infect Dis，2005，5（1）：31-41.

［5］ Stunell H，Buckley O，Geoghegan T，et al.Recurrent pyogenic cholangitis due to chronic infestation withClonorchissinensis［J］.Eur Radiol，2006，16（11）：2612-2614.

［6］ 吴 德，余新炳，吴忠道.华支睾吸虫病的流行概况［J］.热带医学杂志，2002，2（3）：277-279.

［7］ 许隆祺，余森海，徐淑惠.中国人体寄生虫分布与危害［M］.北京：人民卫生出版社，1999.

［8］ 全国人体重要寄生虫病现状调查办公室.全国人体重要寄生虫病现状调查报告［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23（S）：332-340.

［9］ Müller B，Schmidt J，Mehlhorn H.PCR diagnosis of infections with different species of Opisthorchiidae using a rapid clean-up procedure for stool samples and specific primers［J］.Parasitol Res，2007，100（3）：905-909.

［10］ Lier T，Simonsen G S，Haaheim H，et al.Novel real-time PCR for detection ofSchistosomajaponicumin stool.［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，2006，37（2）：257-264.

［11］ 陆正贤，许 静，龚 唯，等.聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA的实验研究［J］.中国人兽共患病学报，2007，23（5）：479-483.