金 彪，伍成奇，唐 攀，邱渊皓，刘万华，武 宁，王晶钰

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

β-内酰胺类抗生素包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类和青霉烯类酶抑制剂等。头孢菌素类抗生素是从头孢菌素的母核7-氨基头孢烷酸连接不同侧链而制成的半合成抗生素。药物首先发现于1945年［1］，经过一段时间的实验室研究，于1963年被正式应用于临床当中，并且根据临床的应用情况不断改进。由于头孢菌素类抗生素的广泛应用，其耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来了困难。大肠埃希菌（E.coli）产β-内酰胺酶是β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制，由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是新一代β-内酰胺酶类抗生素耐药的主要原因，使包括第三代头孢菌素在内的多种β-内酰胺类抗生素失活，还能水解第四代头孢菌素以及单环类抗生素的质粒介导的β-内酰胺酶（β-lactamases，BLA）［2-3］。ESBLs是由质粒介导的，它可以通过接合、转化、转导等形式获得或转移耐药基因。根据ESBLs基因和蛋白质的同源性将其分为四类，即TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型酶［4］，本次研究采用了前三类酶。目前，产β-内酰胺酶是E.coli对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制，医学研究较多，但国内兽医临床鲜有报道。因此，本研究目的是了解鸡源致病性E.coli对β-内酰胺类抗生素的耐药情况及耐药基因与耐药性的相关性，旨在为临床合理用药以及E.coli耐药机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源及其培养 108株鸡源致病性E.coli，2012年8月～10月先后分离自陕西省几个主要规模化养鸡场的鸡群。无菌操作采集上述规模化养鸡场的鸡群疑似感染E.coli的病、死鸡肺脏、肝脏样本，接种麦康凯琼脂平板培养基初步分离，通过培养特性观察、生化试验、动物致病性试验共分离鉴定出108株致病性E.coli，由西北农林科技大学动物医学院动物性食品卫生检验实验室保存。

1.1.2 培养基及药敏纸片 麦康凯琼脂和营养琼脂，购自北京奥博星生物技术有限公司；细菌微量生化反应管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；7种β-内酰胺类药敏纸片（头孢派酮、头孢他啶、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢曲松、头孢呋肟、头孢噻吩），购自杭州天和微生物试剂公司。

1.1.3 主要试剂 PCR Master Mix（含Taq DNA聚合 酶、dNTP、PCR buffer）、DNA Marker DL 2 000，购自宝生物工程（大连）有限公司；NaCl，购自四川西陇化工有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨，购自英国Oxoid公司；溴化乙锭（100mg），购自广州宝泰克生物科技有限公司；琼脂糖，西班牙Biowest公司产品；胶回收试剂盒，购自天根生化科技有限公司。

1.1.4 耐药基因引物设计 根据GenBank中已发表的β-内酰胺酶的耐药基因序列，用Primer5.0软件分别设计针对β-内酰胺酶tem、ctx-m和shv的3种特异性引物，设计的引物序列见表1。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR扩增引物Table 1 The primers for PCR amplification

1.2 方法

1.2.1 细菌的药物敏感性试验 参照CLSI（clinical and laboratory standards institute）推荐的K-B药敏纸片法对108株鸡源致病性E.coli进行药物敏感性试验，判定结果参照CLSI手册中药物敏感性标准［5］。

1.2.2 耐药基因的PCR扩增 将待检菌株划线接种麦康凯琼脂培养基平板，37℃培养24h，挑取菌落溶于500μL无菌纯水的离心管中制成浓菌悬液，100℃煮沸10min，12 000r／min离心5min，取上清作为模板，并保存于-20℃备用。PCR反应体系：2×PCR Master Mix（含有2×TaqDNA 聚合酶，2×PCR buffer 和 2×dNTP）10μL，10 pmol／μL上、下游引物各0.5μL，ddH2O 10μL，模板为4μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃50s，50s，72 ℃ 60s，共35个循环；72 ℃ 10 min；4℃结束反应。取10μL产物用10g／L琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像仪成像观察拍照。

1.2.3 PCR产物的测序分析 将耐药基因的PCR阳性产物用胶回收试剂盒回收，送由南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定，用DNA Star软件对测序获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对分析。

2 结果

2.1 致病性E.coli分离株的耐药性

108株鸡源致病E.coli分离株的药敏试验结果见表2。

从表2可以看出，7种β-内酰胺类药物中，致病性E.coli对头孢噻吩的耐药率最高（95.7%），对头孢他啶的耐药率最低（18.5%），其余的耐药率均超过70%。总的来看，致病性E.coli对头孢菌素类药物的耐药率均较高。

表2 分离的致病性E.coli的耐药情况Table 2 Antimicrobial resistance of pathogenic Escherichia coli isolated from chickens

2.2 致病性E.coli分离株耐药基因的PCR检测

采用PCR技术，对108株鸡源致病性E.coli分离株进行了3种β-内酰胺酶耐药基因的扩增检测，tem和ctx-m2种耐药基因被检出，获得与预期目的片段大小相符的扩增条带（图1，图2），检出率分别为98.1%和74.1%，未检测到shv基因

2.3 致病性E.coli耐药表型与耐药基因检出情况比较

耐药基因在鸡源致病性E.coli耐药菌株中的检出情况见表3。从表3可以看出，耐药基因tem在头孢他啶和头孢呋肟耐药菌株中检出率最高，达100%，除了在头孢曲松耐药菌株中为79.6%外，其余的检出率都超过了95%，与菌株耐药性有显著相关性（P＜0.05）；耐药基因ctx-m在头孢噻吩耐药菌株中检出率最高达86.3%，最低的是在头孢他啶耐药菌株也达到了50%，与菌株耐药性有显著相关性（P＜0.05）；tem＋ctx-m两种耐药基因的检出率除了在头孢他啶耐药菌株中与ctx-m的一样外，其余的都比ctx-m的检出率略低。耐药基因shv的检出率为0。

图1 tem阳性菌株PCR产物扩增图Fig.1 PCR products of tem positive isolates

图2 ctx-m阳性菌株PCR产物扩增图Fig.2 PCR products of ctx-m positive isolates

表3 致病性E.coli耐药株耐药基因的检出率Table 3 Detection rates of resistance genes in resistant isolates of pathogenic Escherichia coli

2.4 耐药基因测序分析

检出的2种β-内酰胺酶耐药基因的特异性目的条带，经回收测序后，分别与GenBank中的相应序列进行比对，结果显示，阳性菌株携带的β-内酰胺酶耐药基因与GenBank中提供的相应基因序列相似性均高达98%以上，其中tem基因为99.3%，ctx-m为98.6%。

3 讨 论

β-内酰胺类药物是医学临床上应用最为广泛的抗菌药物之一，在兽医临床上也发挥着及其重要的作用，随着该类药物的大量使用，耐药性问题也越来越突出，严重影响了该药物的临床疗效，已成为国内外耐压性研究关注的焦点。目前在许多国家和地区有大量关于E.coli耐药性的研究［6-7］，E.coli的耐药性已经成为全球性问题。目前，在已发现的ESBLs基因型中，tem有168种，shv有114种，ctx-m有89种［8］。tem已是ESBLs中最常见的基因型广谱抗生素，特别是第三代头孢菌素在临床上的广泛使用以来，使得质粒介导的产ESBLs细菌在中国不同地区广泛传播［9］。本文PCR结果显示陕西部分地区tem基因检出率最高。

张利勃等［10］研究发现，辽宁省ESBLs鸡源E.coli基因亚型以tem为主，其次为ctx-m型，未发现shv型基因，与本研究结果一致。

国内外对E.coli中质粒介导的耐药基因已有报道，但是种类单一，对于鸡源致病性E.coli耐药基因的全面研究和报道相对较少。Meunier D等［11］对法国E.coli分离株进行β-内酰胺酶基因研究，发现blaTEM和blaCTX-M的检出率分别为62.5%和100%。

Li L等［12］研究发现，我国鸡源E.coli中β-内酰胺酶基因blaTEM和blaSHV在1970年-2003年检出率有所下降，2004年-2007年又逐渐上升。Tang X等［13］对我国2004年-2007年猪源致病性E.coli耐药基因检测时发现，β-内酰胺类耐药基因以blaTEM为主，检出率为87%；杨澍等［14］对人源E.coliβ-内酰胺酶耐药基因进行检测发现，耐药基因以blaTEM为主，本研究结果与其基本一致，这可能与耐药基因在细菌间转移有关。Jacob S等［15］报道，ESBLs菌可通过接合、转化和转导等方式使耐药菌基因在细菌间快速传播扩散，给临床治疗带来困难，进一步说明加强β-内酰胺酶监测的迫切性和必要性。本研究结果为β-内酰胺类抗生素的合理使用和耐药机制的研究提供了数据支持。

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